DNA提取和制備解讀

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA提取和制備解讀一、提取DNA總的原則：1保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。第1頁/共31頁二、樣本來源：理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取DNA樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)康娜腔蚪M提取最常見的樣本第2頁/共31頁血清、血漿、外周血有核細(xì)胞、痰液、體液、棉拭子采集的各種分泌物、組織（包括骨髓）和羊水等都是分子診斷的檢驗(yàn)材料，其中全血、血漿（血清）標(biāo)本占分子診斷的60%以上

第3頁/共31頁DNA提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：（一）全血

1.抗凝劑

EDTA-Na2或枸櫞酸鈉作為抗凝劑不宜使用肝素

抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80℃保存2個(gè)月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差第4頁/共31頁（二）血漿和血清血漿和血清是檢測釋放入血的游離核酸最主要的標(biāo)本來源，用來檢測病毒、細(xì)菌，以及腫瘤細(xì)胞等等釋放出來的游離核酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原微生物和腫瘤標(biāo)志基因的檢測.第5頁/共31頁三、DNA的收率樣本類型基因組DNA收率20mg肝臟組織8g100mg豆苗10g100l全血2g2106培養(yǎng)細(xì)胞10g第6頁/共31頁四、DNA提取的基本步驟1、核酸的釋放：

破裂細(xì)胞釋放核酸（機(jī)械法與非機(jī)械法）

2、核酸的分離與純化3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌

4、DNA鑒定：濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定

第7頁/共31頁五、DNA提取試驗(yàn)中常遇到的問題基因組DNA收率較低或無基因組DNA樣本材料太少細(xì)胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相分離不完全…

…第8頁/共31頁DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時(shí)加入蔗糖的原因加入多糖，保護(hù)DNA長度第9頁/共31頁不可忽視的細(xì)節(jié)

—血液基因組提取天根生化科技（北京）有限公司第10頁/共31頁沒有嚴(yán)格要求:PCRSouthernBlotsRFLP嚴(yán)格要求片段長度:

構(gòu)建文庫

PFGE(脈沖場凝膠電泳)DNALengthDNA提取原則1：DNA片段長度第11頁/共31頁沒有嚴(yán)格要求

常規(guī)PCR嚴(yán)格要求產(chǎn)物純度存檔、產(chǎn)物長期保存

Southern雜交熒光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比較基因組雜交)DNA提取原則2：DNA產(chǎn)物純度第12頁/共31頁基因組提取方法溶液鹽析法：無需酚氯仿，樣本量靈活可變，得率高硅膠膜吸附法：利用硅膠膜特異吸附核酸的原理來純化核酸磁珠法：獨(dú)特包埋的磁珠，在一定條件下對核酸具有很強(qiáng)的親和力，而當(dāng)條件改變時(shí)，磁珠釋放吸附的核酸，能夠達(dá)到快速分離純化核酸的目的。傳統(tǒng)酚氯仿法：傳統(tǒng)方法，抽提時(shí)間長，成本低。但酚氯仿有毒，危害身體健康。第13頁/共31頁樣本保存和前處理－抗凝血液保存檸檬酸、EDTA、肝素三種抗凝劑均可使用。但肝素對酶反應(yīng)有可能起阻害作用,采血時(shí)如沒有特殊要求,請使用檸檬酸或EDTA處理血樣。

加入抗凝劑混勻后2-8℃保存一周；－20℃保存一個(gè)月；－70℃長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。樣本前處理

1.凍存的抗凝血液使用前溶解應(yīng)在37℃水浴迅速溶解。

2.抗凝血提取前需要徹底混勻后再吸取實(shí)驗(yàn)所需的體積。第14頁/共31頁樣本保存和前處理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝塊。-20℃保存一個(gè)月；-70℃長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。樣本前處理

1.

凍存的血凝塊使用前應(yīng)在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。

2.血凝塊取出后先采取機(jī)械破碎的方法（例如：放入無粉橡膠手套中捏碎或勻漿）將血凝塊破碎，然后再根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)取適量樣本。血凝塊前期破碎程度越高，提取基因組就越容易！第15頁/共31頁樣本保存和前處理－白膜層保存全血分離得到的白膜層放置-20℃或-70℃長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。樣本前處理

1.白膜層是將全血離心取中間層所得。白細(xì)胞則是用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后得到的沉淀。

2.凍存的白膜層使用前應(yīng)在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。

3.雖然得到的是白膜層，但是會(huì)有少量紅細(xì)胞存在，所以紅細(xì)胞裂解液還是必要的，但用量減半。

4.采用白膜層提取核酸時(shí)，所用到的提取溶液體積需按照全血體積進(jìn)行操作。即：1ml全血得到的白膜層提取時(shí)需要加入提取1ml全血的試劑量。第16頁/共31頁樣本保存和前處理－血清/血漿保存現(xiàn)在很多科研者使用血清/血漿提取游離核酸進(jìn)行研究，例如：腫瘤研究。分離得到的血清/血漿放置-70℃保存。盡量避免樣本反復(fù)凍融。樣本前處理

1.

凍存的血清/血漿使用前溶解應(yīng)在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。

2.血清/血漿核酸提取時(shí)無需紅細(xì)胞裂解。

3.只需100-200ul樣本，基本能滿足下游常規(guī)PCR或熒光定量PCR檢測。第17頁/共31頁樣本保存和前處理－微量血液/干血點(diǎn)/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；

干血點(diǎn)：干燥后室溫或4℃保存；

羊水：-20或-70℃保存。樣本前處理

1.

微量血液處理同抗凝血液，不同之處是無需進(jìn)行紅細(xì)胞裂解步驟。

2.干血點(diǎn)加入緩沖液直接進(jìn)行提取。

3.羊水/胸水提取時(shí)先離心得到沉淀，再進(jìn)行裂解提取核酸。第18頁/共31頁樣本保存和前處理－口拭子/漱口水保存口拭子：干燥后室溫保存

漱口水：4℃保存或離心得到沉淀-20℃或-70℃保存樣本前處理

1.拭子將拭子棉頭剪入到離心管里，加入緩沖液直接進(jìn)行提取。

2.有些拭子的棉頭剪不下來，可以將拭子在生理鹽水里漂洗幾次，離心得到沉淀再進(jìn)行核酸提取。

3.漱口水先進(jìn)行離心得到沉淀再進(jìn)行核酸提取。第19頁/共31頁基因組提取流程加入吸附柱緩沖液漂洗DNA洗脫收集樣本裂解純化去蛋白沉淀核酸洗滌去鹽溶解DNA沉淀樣本裂解溶液法（鹽析法）吸附柱法第20頁/共31頁紅細(xì)胞裂解哺乳動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核且核酸酶含量豐富，所以裂解紅細(xì)胞對核酸提取非常重要。紅細(xì)胞裂解有兩種方式：采用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（通常紅細(xì)胞裂解液按照3倍全血體積加入進(jìn)行裂解).采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（TIANGEN的細(xì)胞裂解液CL是按照2.5倍全血體積），細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解的同時(shí)可以裂解白細(xì)胞，得到的為細(xì)胞核沉淀，更方便基因組DNA的提取。紅細(xì)胞裂解充分的現(xiàn)象：

得到的沉淀應(yīng)為白色沉淀或淡粉色沉淀。有時(shí)血液需要進(jìn)行兩次裂解，注意第二次加入裂解液后需要將沉淀votex徹底混勻。第21頁/共31頁核細(xì)胞裂解如果有裂紅的步驟，請盡量將上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN試劑盒中的GB或FG）和蛋白酶K需要徹底混勻。將沉淀打散混勻后再進(jìn)行水浴。水浴時(shí)看到溶液變清，沒有粘稠物或沉淀時(shí)即可進(jìn)行下步操作，通常水浴時(shí)間10-30min.若采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，動(dòng)作要輕柔。離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，且吸取上清時(shí)注意不要吸取到中間層及有機(jī)相。第22頁/共31頁核酸吸附或沉淀硅膠膜吸附法

1.加入乙醇顛倒混勻后可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，動(dòng)作要輕柔。

2.將裂解的溶液和絮狀沉淀全部加入到吸附柱里，此時(shí)的溶液應(yīng)是高鹽低pH值的。通過硅膠膜特異吸附核酸的特性將裂解溶液中的核酸吸附到硅膠膜上。溶液法

1.當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分。

2.加入異丙醇顛倒混勻后應(yīng)出現(xiàn)絲狀沉淀，動(dòng)作要輕柔，避免基因組因過于猛烈的外力而降解。

3.分離沉淀的方法：a.用槍頭小心地將絲狀沉淀挑出；b.離心分離，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。第23頁/共31頁核酸洗脫或溶解硅膠膜吸附法

1.用去蛋白液、漂洗液將膜上的核酸漂洗后，將不加溶液的吸附柱離心以去除殘留的液體及揮發(fā)乙醇成分。加入適量洗脫液TBbuffer（或自己配制的buffer）后放置5-10min后再進(jìn)行離心得到基因組DNA。溶液法

1.使用70-75％乙醇對核酸沉淀進(jìn)行洗滌。溶解DNA前需要室溫或37℃放置幾分鐘晾干核酸（使乙醇揮發(fā)），然后再加入適量的TBbuffer（或自己配制的buffer）溶解DNA。第24頁/共31頁濃度：100－300ng/ul純度：任何雜質(zhì)都可能導(dǎo)致DNA在儲(chǔ)存過程中的降解，因此要確保純化得到的核酸的純度。溫度：純化得到基因組DNA之后需將DNA溶液分裝保存到-20℃，反復(fù)凍溶會(huì)導(dǎo)致DNA的降解。溶解DNABuffer：純化得到的基因組DNA最好溶解在TBBuffer(TIANGEN)或者Tris緩沖液里，因?yàn)榇笃蔚幕蚪MDNA在酸性水溶液中不穩(wěn)定，易水解。核酸保存第25頁/共31頁純度（OD260-320/OD280-320）

紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測量（選擇正確的稀釋倍數(shù)，確保OD260值在0.1~1.0之間，通常離心柱法稀釋4－5倍；溶液裂解法稀釋20－30倍）

OD260-320/OD280-320<1.7說明有蛋白的污染

OD260-320/OD280-320＝1.7～1.9說明純度很好

OD260-320/OD280-320>1.9說明有部分降解或有RNA污染得率

紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測量

Yield＝OD260×50ng/ul×稀釋倍數(shù)DNA檢測方法－紫外分光光度法第26頁/共31頁Tiangen產(chǎn)品提取得率產(chǎn)品詳細(xì)細(xì)節(jié)請直接點(diǎn)擊產(chǎn)品名稱樣本處理量DNA/RNA得率（μg）推薦試劑盒哺乳動(dòng)物全血100μl2DP327-磁珠法基因組提取試劑盒DP316-微量樣品基因組DNA提取試劑盒200μl4-12DP318-血液基因組提取試劑盒(0.1-1ml)600μl12-201ml4-30DP319-血液基因組提取試劑盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽類、兩棲類全血5-205-40DP318-血液基因組提取試劑盒(0.1-1ml)血凝塊200-500ul1-8DP318/DP319500-1000ul8-15DP318/DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子1個(gè)0.5-3.5DP322-口腔拭子基因組提取試劑盒第27頁/共31頁DNA檢測方法－電泳檢測取2μl洗脫液1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA分子大小，純度以及完整性TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒提取相同血樣不同起始體積的DNA電泳圖電泳檢測要控制上樣量。上樣量過大會(huì)導(dǎo)致泳道過亮、拖尾等現(xiàn)象，影響正確判斷。如果加樣孔里有亮帶，說明有蛋白污染。若上樣量合適，泳道有彌散、拖尾現(xiàn)象，說明書基因組DNA有降解。第28頁/共31頁TIANamp微量樣本基因組DNA提取試劑盒樣本來源一致，分別取1μl，10μl，50μl，100μl為起始樣本提取基因組。各取2μl基因組DNA為模板，擴(kuò)增GAPDH基因，熒光定量PCR分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。DNA檢測方法－熒光定量PCR檢測微量樣本基因組DNA的檢測通常采用熒光定量PCR檢測，例如：干血點(diǎn)、微量血液等。第29頁/共31頁試劑選擇指南硅膠膜吸附法微量樣本（D