DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與

會計學1DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與在2002年4月，美國《科學》雜志，登載了一篇長達14頁的論文尤其引人注目———《水稻（秈稻）基因組的工作框架序列圖》。

2004年12月，水稻基因組“精細圖”全部完成第1頁/共27頁2004年12月10日，中國科學家在世界上率先完成的家蠶基因組“框架圖”及基因組生物學分析成果在世界科學類權(quán)威的學術(shù)期刊——《Science》雜志上發(fā)表。第2頁/共27頁2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因研究院領(lǐng)銜完成的大熊貓基因測序。第3頁/共27頁為什么要進行DNA測序？DNA測序的目的就是為了認識生命的本質(zhì)，了解生物的差異性，以及不同的生物進化和發(fā)展的歷史。DNA測序?qū)χ亟MDNA的研究提供了方向。DNA測序在疾病診斷和基因分型中有重要的實用價值第4頁/共27頁

DNA測序技術(shù)對象的發(fā)展

自20世紀70年代DNA序列分析技術(shù)發(fā)明以來，人類對基因和基因組結(jié)構(gòu)的研究和探索就沒有停止過。1977年測定了噬菌體X174基因組全部核苷酸序列。目前，已分析完成了大批生物的全部基因組序列，包括噬菌體、病毒、細菌、酵母、多細胞真核生物、小鼠和人類。2001年初完成的人類基因組計劃使基因組研究達到了高潮，是人類真正認識和自我改造的開端。第5頁/共27頁第一代DNA測序技術(shù)

三測序方法的原理第二代DNA測序技術(shù)

三個測序平臺的工作原理及操作步驟第三代DNA測序技術(shù)單分子測序的特點及應(yīng)用前景DNA測序技術(shù)的歷史自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個測序技術(shù)的發(fā)展歷程。第6頁/共27頁第一代DNA測序技術(shù)

成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀70年代中期?！?977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法。●同一時期,Maxam和Gilbert報道了通過化學降解測定DNA序列的方法。●20世紀90年代初出現(xiàn)的熒光自動測序技術(shù)將DNA測序帶入自動化測序的時代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。第7頁/共27頁一，雙脫氧鏈終止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種dNTP

存在條件下復(fù)制時,在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),因為雙脫氧核苷沒有3′-OH,所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長,若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3′端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后,分4個泳道進行凝膠電泳,分離長短不一的核酸片段,長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3′端的雙脫氧核苷,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。第8頁/共27頁二，化學降解法在該方法中,一個末端被放射性標記的DNA片段在5組互相獨立的化學反應(yīng)中分別被部分降解,其中每一組反應(yīng)特異地針對某種堿基。生成5組放射性標記的分子,每組混合物中均含有長短不一的DNA分子,其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA片段上的位置。最后,各組混合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。第9頁/共27頁三，熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用四種不同的熒光混合物分別標記四種反應(yīng)的產(chǎn)物，用四種反應(yīng)物混合在一起進行電泳，在激光的激發(fā)下四種帶有不同熒光染料標記物的ddNTP可以在同一反應(yīng)管種進終止測序反應(yīng)，并于變性的聚丙烯酰胺凝膠的同一泳道中進行電泳檢測。當帶有某種熒光素標記的DNA片段電泳到激光探頭的檢測范圍時，激光所激發(fā)的熒光信號被探測器接受，經(jīng)計算機分析數(shù)據(jù)，自動排列出DNA序列。第10頁/共27頁第一代測序法的比較方法雙脫氧末端終止法化學降解法熒光自動測序技術(shù)優(yōu)點操作簡便，結(jié)果清晰可靠，一次能確定300-500個核苷酸序列，已成為最常用的DNA測序方法不需要進行酶促反應(yīng)，可以分析甲基化等DNA的修飾情況自動化程度高，高效率，精確度增加缺點花費時間過久，成本較高一次最多只能分析250個核苷酸，所用的許多化學試劑有毒純化量小，不能純化較長的片段第11頁/共27頁第二代DNA測序技術(shù)

·羅氏454公司的GSFLX測序平臺

·Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺

·ABI公司的SOLiD測序平臺二代測序的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。第12頁/共27頁

一、GSFLX測序技術(shù)的原理1.樣品輸入并片段化：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。2.文庫制備：借助一系列標準的分子生物學技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3.一個DNA片段＝一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應(yīng)器4.乳液PCR擴增：每個獨特的片段在自己的微反應(yīng)器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片段而言，擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。第13頁/共27頁5.一個磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測序開始。放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個合成反應(yīng)和一個化學發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應(yīng)釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應(yīng)，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。第14頁/共27頁

一、GSFLX測序技術(shù)的優(yōu)點GSFLX系統(tǒng)的測序也是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術(shù)。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將優(yōu)點引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；特點：分析結(jié)果快速、準確、靈敏度高和自動化。第15頁/共27頁

Solexa測序技術(shù)路線：GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因為3’羥基末端帶有可化學切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達到2×50bp，更長的讀長也能實現(xiàn)，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。4.數(shù)據(jù)分析

第16頁/共27頁Solexa測序技術(shù)的特點①通量高。目前一臺機器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G的數(shù)據(jù);②準確率高?！?8.5%，同時也有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題;③成本低。低于傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)成本的1%;④DNA序列的讀取長度不斷增加，當前單條序列讀長可達到150bp;⑤可以進行Pair-end(PE)雙向測序，PE文庫插入片段大小范圍可由150bp到10kb。正確選擇插入片段長度有利于高重復(fù)序列含量基因組的組裝，這進一步擴展了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。第17頁/共27頁ABI測序技術(shù)ABI3730XL的測序原理ABI3730xl常規(guī)測序平臺采用毛細管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。第18頁/共27頁#三種第二代測序技術(shù)對比#測序技術(shù)454SolexaSOLiD上市時間200520072007價格（萬美元，2007）504559單次反應(yīng)數(shù)據(jù)量0.42050讀長（bp）40010050優(yōu)勢長讀長低測序成本，高性價比高通量，高準確度第19頁/共27頁第三代DNA測序技術(shù)

第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時候都需要經(jīng)過PCR擴增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進行數(shù)據(jù)拼接時會遇到麻煩。為了克服這樣的缺點，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實時測序和納米孔為標志的第三代測序技術(shù)。

第20頁/共27頁1.Helicos公司

Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標記的dNTP進行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫。檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學試劑去掉熒光標記，以便進行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。第21頁/共27頁2.PacificBiosciences公司

PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為測序載體進行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標記的dNTP放入ZMW孔的底部，進行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標記的位置是磷酸基團而不是堿基。當一個dNTP被添加到合成鏈上的同時，它會進入ZMW孔的熒光信號檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號檢測區(qū)停留的時間（毫秒級）與它進入和離開的時間（微秒級）相比會很長，所以信號強度會很大。其它未參與合成的dNTP由于沒進入熒光型號檢測區(qū)而不會發(fā)出熒光。在下一個dNTP被添加到合成鏈之前，這個dNTP的磷酸基團會被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號檢測區(qū)。第22頁/共27頁3.OxfordNanoporeTechnologies公司OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號測序的技術(shù)。他們設(shè)計了一種以α-溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割ssDNA時，被切下來的單個堿基會落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強度，這種電流強度的變化幅度就成為每種堿基的特征。第23頁/共27頁

中國機構(gòu)主要承擔和參與已完成的動植物基因組測序項目

物種國內(nèi)主要承擔機構(gòu)人中國科學院華大基因研究中心等水稻中國科學院華大基因研究中心等

家蠶西南農(nóng)業(yè)大學、中國科學院北京基因組研究所和華大基因研究中心等家雞中國科學院北京基因組研究所和華大基因研究中心等人深圳華大研究院等血吸蟲南方基因中心等黃瓜深圳華大研究院等