DNA測序技術(shù)總結(jié)

會計學1DNA測序技術(shù)總結(jié)一、DNA序列測定的意義二、測序技術(shù)的建立三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展四、DNA測序技術(shù)的展望五、DNA測序技術(shù)的應用第1頁/共45頁

DNA的序列測定是分子生物學研究中的一項非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNA一級結(jié)構(gòu)的詳細了解。一、DNA序列測定的意義第2頁/共45頁

人類基因組計劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于2003年完成。人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工程，它奠定了21世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。造福人類的HGP第3頁/共45頁1949年,FrederickSanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù),1953年測定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質(zhì)的N端測序技術(shù),后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術(shù)。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測定法,并完成了大腸桿菌5SrRNA的120個核苷酸的測定。同一時期,Holley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運tRNA的序列測定。蛋白質(zhì)和RNA的測序技術(shù)二、測序技術(shù)的建立第4頁/共45頁1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測定DNA序列。1977年，Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測定的效率和準確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報道了化學降解法測定DNA的序列。DNA測序技術(shù)的建立第5頁/共45頁DNA序列測定技術(shù)出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質(zhì)和RNA測序技術(shù),成為現(xiàn)代分子生物學中最重要的技術(shù)。第6頁/共45頁三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展第一代DNA測序技術(shù)第二代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)第7頁/共45頁1、第一代DNA測序技術(shù)第一代DNA測序技術(shù)：傳統(tǒng)的化學降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)。第一代DNA測序技術(shù)包括：化學降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動測序技術(shù)和雜交測序技術(shù)。第8頁/共45頁1.1化學降解法基本原理:利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機斷裂DNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測出DNA的序列。第9頁/共45頁

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線第10頁/共45頁堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert法所用的化學技術(shù)第11頁/共45頁第12頁/共45頁化學降解法剛問世時，準確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。但化學降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡便快速的Sanger法所代替。第13頁/共45頁1.2雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。該法的原理是：利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨立的測序反應體系，在每個反應體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導下，按照堿基配對原則，每個反應體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。第14頁/共45頁

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH第15頁/共45頁雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖

第16頁/共45頁Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動測序技術(shù)。第17頁/共45頁1.3熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標記代替同位素標記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術(shù)的DNA測序儀。如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標記，在通過毛細管時不同長度的DNA片段上的4種熒光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCD檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNA序列。第18頁/共45頁目前所用自動測序技術(shù)的改進第19頁/共45頁3730

全自動測序儀第20頁/共45頁1.4雜交測序技術(shù)該方法不同于化學降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交測序檢測速度快，采用標準化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術(shù)的特點。但該方法誤差較大，且不能重復測定。第21頁/共45頁通過幾十年的逐步改進,第1代測序儀的讀長可以超過1000bp,原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%,測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達到600000堿基。第22頁/共45頁第一代測序技術(shù)在分子生物學研究中發(fā)揮過重要的作用,如人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA測序技術(shù)。目前基于熒光標記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀仍被廣泛地應用。隨著人類基因組計劃的完成,人們進入了后基因組時代,即功能基因組時代,傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測序和重復測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求,這促使了新一代DNA測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)即第二代測序技術(shù)。第23頁/共45頁2、第二代DNA測序技術(shù)第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GSFLX測序平臺、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺。第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第24頁/共45頁第二代測序技術(shù)將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成。然后進行引物雜交和酶延伸反應。由于所有的克隆都在同一平面上,這些反應就能夠大規(guī)模平行進行,每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行,從而獲得測序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測不斷重復,最后經(jīng)過計算機分析就可以獲得完整的DNA序列信息。

第二代測序技術(shù)包括：454測序技術(shù)、Solexa測序技術(shù)和SOLiD測序技術(shù)。第25頁/共45頁2.1454測序技術(shù)

原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。第26頁/共45頁第27頁/共45頁454生命科學公司在2005年最早推出了第二代測序平臺GenomeSequencer20，并測序了支原體Mycoplasmagenitalium的基因組。并在2007年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。羅氏在2005年便與454公司洽談并購事宜，2007年完成并購，緊接著公布了DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一——沃森(JimWatson)的個人基因組，測序總花費不到一百萬美元。第28頁/共45頁2.2Solexa測序技術(shù)

核心技術(shù)：“DNA簇”和“可逆性末端終止”。原理：將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億計Cluster，每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。Illumina公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測序(SequencingbySynthesis)的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。第29頁/共45頁GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到2×50bp，每次運行后可獲得超過20GB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術(shù)。第30頁/共45頁SOLID通過連接反應進行測序。其基本原理是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：文庫準備擴增微珠與玻片連接連接測序超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLID3單次運行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍人類基兇組覆蓋度。2.3SOLiD測序技術(shù)第31頁/共45頁第32頁/共45頁3、第三代DNA測序技術(shù)第三代測序技術(shù)是以單分子測序為特點的測序技術(shù)。如生物科學公司(BioScienceCorporation)的HeliScope單分子測序儀(HeliScopeSingleMolecularSequencer)以及正在研制的太平洋生物科學公司(PacificBiosciences)的單分子實時DNA測序技術(shù)[SingleMoleculeRealTime(SMRT)DNAsequencingtechnology]和牛津納米孔技術(shù)公司(OxfordNanoporeTechnologiesLtd)的納米孔單分子測序技術(shù)等。第33頁/共45頁

目前,我國也啟動了第三代測序技術(shù)的研究。2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學聯(lián)合實驗室”,利用各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀,第一臺樣機預計2013年問世,屆時有望緩解測序儀核心技術(shù)受制于國外公司的現(xiàn)狀。第二代的高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應用,但是由于其測序速度、成本、準確度等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測序解決方案。單分子測序也就應運而生。第34頁/共45頁第三代測序技術(shù)非常驚人！1、它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍。2、它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達到99.9999%。4、可直接測RNA序列。5、可直接測甲基化的DNA序列。第35頁/共45頁

2008年4月，HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù),并利用該技術(shù)對一個M13病毒基因組進行重測序。這項技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序,是因為它完全跨過了前述3種高通量測序依賴的基于PCR擴增的信號放大過程,真正達到了讀取單個熒光分子的能力。斯坦福大學的科學家最近利用Heliscope單分子測序儀,用了48000美元的試劑和4個星期的時間,對一名白人男子的基因組進行了測序。測序的覆蓋度達28倍,覆蓋了90%的人類參考基因組。序列讀長24-70bp,平均讀長為32bp,并鑒定出280萬個SNP位點和752個拷貝數(shù)變異。3.1HeliScope單分子測序儀第36頁/共45頁Pacificbioscience在Science上報道了他們的基于SMART技術(shù)的單分子測序技術(shù),該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶,在聚合反應的同時就可以讀取測序產(chǎn)物,目前一期的讀取速度為3bp/s,但他們聲稱在2013前實現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。Pacific技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時的評價讀長為586個堿基,有些能達到2805堿基,新儀器的單個讀長已達10351個堿基,而且有望實現(xiàn)更大的讀長,而且準確率＞99.9999%。3.2單分子實時DNA測序技術(shù)第37頁/共45頁英國牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分子測序技術(shù),該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快,而且成本會大大降低

。在該測序技術(shù)平臺中,DNA分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔,利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNA堿基,同時還能檢測出堿基是否被甲基化等相關(guān)的重要信息。3.3納米孔單分子測序技術(shù)第38頁/共45頁據(jù)2010年7月30日XiaoYan（NanoLett，July30，2010）報道，美國賓夕法尼亞大學的研究人員開發(fā)出一個納米級的碳基平臺，可用于電子探測單個DNA分子。該技術(shù)最終有望在快速DNA電子測序方面發(fā)揮“用武之地”。這個納米平臺由石墨烯制成。研究小組利用電子束技術(shù)，在石墨烯膜上燒灼出納米大小的小孔，在電場的作用下，微小的DNA鏈就可以穿過這些孔洞。通過電子測量手段檢測DNA的易位，再根據(jù)DNA的4個堿基各自獨特的“電子簽名”，就可以快速完成DNA測序。探測單個DNA分子技術(shù)開啟高通量DNA電子測序之門第39頁/共45頁第40頁/共45