免疫細(xì)胞分離與功能檢測

免疫細(xì)胞分離與功能檢測第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日目的要求

掌握：Ficoll-hypaque分層液分離PBMC的原理、方法，淋巴細(xì)胞亞群分離的原理、方法及應(yīng)用，T細(xì)胞增殖試驗的方法，B細(xì)胞的數(shù)量及功能的檢測；熟悉：T細(xì)胞功能的體內(nèi)試驗，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒檢測的方法；了解：淋巴細(xì)胞的純化與亞群分離的方法、吞噬細(xì)胞的分離方法、溶血空斑試驗。第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細(xì)胞的分離及檢測※檢測：各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測定※方法：體外法為主※目的：判斷機體免疫狀態(tài)※意義：探討疾病的發(fā)病機制、發(fā)展、預(yù)后、療效免疫細(xì)胞的分離是指將各種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞從血液或組織中分離出來4第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

免疫細(xì)胞的起源與分化紅細(xì)胞血小板肥大細(xì)胞中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞漿細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細(xì)胞種類第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細(xì)胞的分離流程外周血PBMC純淋巴細(xì)胞T、B細(xì)胞TC亞群/BC亞群第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日PBMC包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞各種血細(xì)胞比重不同,利用密度梯度離心進(jìn)行分離常用分層液：ficoll－h(huán)ypaque，percoll一、外周血單個核細(xì)胞的分離和純化第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.090多核白細(xì)胞1.092紅細(xì)胞1.093外周血各細(xì)胞成分的密度第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

Ficoll分離液法是一種單次差速密度梯度離心的分離法，主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞。Ficoll分層液：密度1.077±0.001離心：密度梯度離心分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布

一、Ficoll分離法第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日Ficoll分層液分離單個核細(xì)胞示意圖第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、淋巴細(xì)胞的分離

純淋巴細(xì)胞群的采集原理：利用單核細(xì)胞在37℃和Ca離子存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據(jù)此建立許多從單個核細(xì)胞中除去單核細(xì)胞的方法，以獲得高純度的淋巴細(xì)胞群。第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日(一)粘附貼壁法因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，因此，本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。(二)吸附柱過濾法

將單核細(xì)胞吸附于玻璃柱中，洗脫下來的主要是淋巴細(xì)胞第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日(三)磁鐵吸引法利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在懸液中加入羰基鐵顆粒，待單核細(xì)胞吞噬鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞群。第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日78％98％（四）Percoll分離法返回章目錄第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的分離免疫磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法其他方法第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）免疫磁珠分離法

第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日488nm激光+-前向散射光檢測器

熒光檢測器電磁場單個細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測管流式細(xì)胞術(shù)分離原理示意圖第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測及亞群分類第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日一、T細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群CD4+TCD8+TCD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+主要為Th（helpTcell）輔助性T細(xì)胞主要為Tc（cytotoxicTcell）細(xì)胞毒性T細(xì)胞第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、B細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群亞群第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日NK細(xì)胞典型標(biāo)志：CD56和CD16三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)抗原提呈細(xì)胞表面標(biāo)志抗原提呈細(xì)胞（APC）：是指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原信息提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一類免疫細(xì)胞。單核-巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日（1）分泌TNF-α、NO、反應(yīng)氧中間產(chǎn)物及蛋白水解酶等（2）ADCC效應(yīng)（3）激活T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子等活化巨噬細(xì)胞協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞。（一）單核吞噬細(xì)胞（CD14）1.吞噬和殺傷作用2.殺傷腫瘤細(xì)胞第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)呈樹突樣具有一些相對特征性表面標(biāo)志抗原提呈能力強能激活初始T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動者二、樹突狀細(xì)胞（dendriticcells，DC）特征：第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.起源于造血干細(xì)胞由髓樣干細(xì)胞（多數(shù)）、淋巴干細(xì)胞分化。2.表面標(biāo)志豐富如：MHCⅡ類分子及Ⅰ類分子、B7-1和B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。3.分泌多種細(xì)胞因子

IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-α等。DC主要標(biāo)志：CD1a、CD11c、CD83第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日第四節(jié)T細(xì)胞功能檢測一、T細(xì)胞功能檢測第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)學(xué)檢查法3H-TdR摻入法MTT比色法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測方法第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)學(xué)檢查法第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理：刺激物37℃56hG1期→S1期

合成DNA↑

3H-TdR37℃16hDNA-3H-TdR測淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（cpm）計算SI判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度外周血（T）G0期3H-TdR摻入法第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日評價：該方法敏感性高、客觀性強、重復(fù)性好、可自動操作；設(shè)備昂貴、放射污染。

刺激指數(shù)（stimulatingindex，SI）

SI=試驗管cpm均值/對照管cpm均值3H-TdR摻入法第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗原理示意3H-TdR摻入法第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運抑制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測出淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，從而確定TH1/TH2細(xì)胞的百分率。淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測（二）T細(xì)胞分泌功能檢定第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++

Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理:靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日試驗方法:同位素法

淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線51Cr特異釋放率=

×100%（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗背景無效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞1:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞5:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞20:1細(xì)胞溶解第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗（四）體內(nèi)試驗第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗二、B細(xì)胞功能檢測第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）溶血空斑試驗溶血斑補體抗血清包被綿羊紅細(xì)胞第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日（二）酶聯(lián)免疫斑點法抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日刺激體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。（三）體內(nèi)試驗第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法放射性核素釋放法流式細(xì)胞術(shù)靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:K562細(xì)胞株三、NK細(xì)胞活性檢測返回章目錄第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日

﹡大吞噬細(xì)胞:即單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)

﹡小吞噬細(xì)胞:即中性粒細(xì)胞第五節(jié)其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)吞噬細(xì)胞的種類第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日特征性標(biāo)志CD14分離技術(shù)Pecoll密度梯度分離法流式細(xì)胞儀分離技術(shù)免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法黏附法一、吞噬細(xì)胞的分離（一）單核細(xì)胞的分離第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日☆斑蝥敷貼法分離人巨噬細(xì)胞☆動物的巨噬細(xì)胞直接從腹腔滲出液中獲?。ǘ┚奘杉?xì)胞的分離第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日聚合物加速沉降法可從外周血中分離出白細(xì)胞RBC血漿(抗凝血)WBCRBC

Ficoll分離法可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞（三）中性粒細(xì)胞的分離第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。（一）中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)二、相關(guān)功能檢測第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞趨化功能的檢測吞噬功能的檢測殺菌功能的檢測（一）中性粒細(xì)胞功能檢測第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日體內(nèi)試驗法：皮膚窗法體外試驗法：濾膜滲透法瓊脂糖平板法趨化功能檢測——檢測細(xì)胞運動功能皮膚窗法在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后開始聚集，達(dá)50～100個，6小時可達(dá)1000個以上。

第五十三頁，共五十八頁，2022