免疫標(biāo)記技術(shù)節(jié)熒光免疫技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)節(jié)熒光免疫技術(shù)第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第十七章熒光免疫技術(shù)第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光免疫技術(shù)的基本原理熒光的基本知識熒光抗體染色的方法及其原理熒光抗體的制備熒光免疫測定的類型及其原理免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用本章要點第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日目錄基本知識1熒光免疫顯微技術(shù)2時間分辨熒光免疫測定3熒光偏振免疫測定4免疫芯片技術(shù)5第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光檢測技術(shù)的敏感性和直觀性相結(jié)合而建立的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。前言第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)基本知識熒光免疫技術(shù)：用熒光素標(biāo)記Ab或Ag，與待測標(biāo)Ag或Ab結(jié)合，通過檢測熒光，確定標(biāo)本中有無相應(yīng)的Ab或Ag。AbF（AgF）+Ag（Ab）AbF-Ag/（AgF–Ab）熒光激發(fā)光檢測

分類熒光免疫分析

（定量）熒光抗體技術(shù)（定位、定性）第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、熒光的基本知識熒光（fluorescence）

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，發(fā)射出的波長大于激發(fā)光波長的光。基態(tài)發(fā)射光（熒光）基態(tài)（熒光物質(zhì)）激發(fā)態(tài)發(fā)射光譜激發(fā)光譜激發(fā)光第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光效率熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率。

發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）熒光效率=第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光壽命

熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。熒光淬滅熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、高溫（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。*熒光免疫檢測中避免熒光淬滅的發(fā)生；消除非特異性熒光（本底）的干擾。第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日Stokes位移熒光物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的過程中，由于部分能量丟失而導(dǎo)致發(fā)射光波長比激發(fā)光波長，兩者波長之差。熒光偏振熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光照射后，吸收光能并發(fā)出單一平面的偏振熒光的現(xiàn)象。第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日

二、常用的熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570nm～575nm595nm～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490nm-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)碘化丙啶（PI）488nm620nm橙紅色Eu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、熒光抗體的制備熒光素攪拌法透析法制備免疫血清親和層析離子交換層析法純化抗體標(biāo)記抗體純化透析法凝膠過濾法鑒定實際應(yīng)用第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)熒光免疫顯微技術(shù)定性和定位檢測，或?qū)ψ陨砜贵w進行定性和滴度測定熒光素標(biāo)記抗體與標(biāo)本片中組織或細(xì)胞抗原結(jié)合，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日

AbF+Ag（組織/細(xì)胞）AbF-Ag檢測特異性熒光紫外線一、基本原理第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、方法類型1.直接法2.間接法3.雙標(biāo)記法第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日固定Ag（待測）＋Ab*——AgAb*快，直接、干擾因素少；常用于檢測Ag

特異性高但敏感度偏低檢測一種Ag，需標(biāo)記一種Ab，較麻煩Ag？

AbF直接法第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日制備一種熒光抗體，可檢測多種Ag或Ab既可檢測Ag，又可檢測Ab。靈敏度高間接法熒光素標(biāo)記抗抗體AgAb抗－Ab*第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本不同抗原表位反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。如：具CD3、CD4表位的Th細(xì)胞。ThCD3CD4（FITC黃綠）（RB200橘紅）第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、關(guān)鍵技術(shù)1.標(biāo)本制作2.熒光抗體染色3.熒光顯微鏡檢查4.熒光抗體染色結(jié)果判讀第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日標(biāo)本制作組織切片：冷凍切片、石蠟切片印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：單層培養(yǎng)細(xì)胞冷凍切片：操作簡單，抗原損失少，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰石蠟切片：組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，抗原損失多固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光抗體染色于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)相關(guān)試劑（含適當(dāng)稀釋的熒光抗體），置濕盒內(nèi)25℃～37℃溫育30分鐘左右或4℃過夜；然后用PBS充分洗滌，待干燥后鏡檢。第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡檢查（熒光顯微鏡）

光源：高壓汞燈氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野相差聚光器鏡頭：消色差鏡頭第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，使紫外線（激發(fā)光）透過。吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護眼睛。熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日透射光：照明光線從標(biāo)本下方經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上方落射到標(biāo)本上，經(jīng)反射進入物鏡。透射熒光光路(a)落射熒光光路(b)熒光顯微鏡光路圖光路熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日設(shè)立實驗對照:陽性對照和陰性對照區(qū)分特異和非特異染色陽性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光顯微鏡檢查（結(jié)果判斷）

“-”：無或極微弱“+”：較弱但清晰可見“++”：明亮“+++”：耀眼對照光：“-”或“±”陽性：特異熒光強度“+”以上效價：呈"+"的血清最高稀釋度第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、方法評價與應(yīng)用方法評價優(yōu)點：可用于抗原或抗體的定位、定性檢查，既有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強。

缺點：熒光容易消退，難以制備永久性標(biāo)本，非特異熒光常干擾結(jié)果判斷。第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)應(yīng)用自身抗體檢測抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用臨床應(yīng)用第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用細(xì)菌（藤黃微球菌)第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計數(shù)。熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞表面抗原和受體檢測第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日其他：如免疫病理、腫瘤等檢測腫瘤抗原（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，并與時間分辨技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型超微量物質(zhì)免疫分析方法，具有靈敏度高、特異性強、發(fā)光穩(wěn)定、自然熒光干擾少、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等特點，已在臨床實驗中廣泛應(yīng)用。第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日AgEu3＋/AbEu3＋+Ag/Ab檢測一、基本原理AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag?Ab/Ag

熒光壽命長：10μs-1000μs，時間差—

時間分辨

Stokes位移大：270nm，易分辨第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日時間分辨短壽命熒光長壽命熒光第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日Eu3+元素的stokes位移第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、方法類型12

3雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日Eu增強液激發(fā)Eu固相Ab待檢AgEu標(biāo)記Ab每一步均需洗滌Eu解離發(fā)光雙抗體夾心法第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日增強液激發(fā)固相AbAg？AgEu3+熒光強度與待檢抗原含量成負(fù)相關(guān)固相抗體競爭法第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日增強液激發(fā)固相AgAg？AbEu3+熒光強度與待檢抗原含量成負(fù)相關(guān)固相抗原競爭法第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、方法評價

靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個數(shù)量級

標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長

測量快速，易自動化易受污染，本底增高第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、臨床應(yīng)用廣泛用于微量或超微量物質(zhì)的檢測，如各種激素（肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等）、蛋白質(zhì)、酶、藥物、腫瘤標(biāo)記物及病毒抗原等的測定。第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)熒光偏振免疫測定（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）

熒光偏振免疫測定是利用抗原抗體競爭反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物之間熒光偏振程度的差異，測定液體中小分子物質(zhì)的含量。第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、基本原理熒光物質(zhì)經(jīng)激發(fā)光照射后，可發(fā)出偏振熒光，其強弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)熒光素標(biāo)記的小分子抗原（AgF）偏振熒光弱；而形成的AgF-Ab分子增大，偏振熒光強反應(yīng)體系中待測Ag與AgF競爭結(jié)合已知抗體，故待測Ag越多，形成AgF-Ab越少，游離AgF多，故待檢Ag含量與偏振熒光強度成反比第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日

（一）FPIA原理熒光偏振免疫測定示意圖第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、方法評價熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復(fù)性好快速，易自動化適于小、中等分子物質(zhì)檢測儀器設(shè)備昂貴，試劑盒專屬性強靈敏度較非均相熒光免疫測定法低第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、臨床應(yīng)用主要用于測定小分子抗原物質(zhì)，是臨床藥物濃度測定的首選方法，目前已有多種藥物、激素、毒品和常規(guī)生化項目可以用本方法進行分析，如環(huán)孢素、苯妥英鈉、卡馬西平、地高辛、丙戊酸、苯巴比妥、氨茶堿及鴉片濃度等測定。第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日第五節(jié)免疫芯