免疫比濁分析

免疫比濁分析第一頁，共四十三頁，2022年，8月28日免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學儀器和自動分析技術(shù)相結(jié)合的一項分析技術(shù)。第二頁，共四十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)自動化免疫比濁分析第一節(jié)免疫比濁的原理一、透射免疫比濁法二、散射免疫比濁法三、免疫膠乳比濁法四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用第三頁，共四十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫濁度分析原理

抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用儀器檢測，用吸光度表示。第四頁，共四十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫濁度分析原理

在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

第五頁，共四十三頁，2022年，8月28日免疫比濁技術(shù)分類：透射免疫比濁法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比濁法（nephelometryimmunoassay）速率散射比濁法終點散射比濁法第六頁，共四十三頁，2022年，8月28日第七頁，共四十三頁，2022年，8月28日一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，由于溶液中的免疫復(fù)合物微粒對光線的吸收、反射和折射而使透射光減少，可用吸光度表示。在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。一、免疫透射比濁法（一）原理：第八頁，共四十三頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)曲線第九頁，共四十三頁，2022年，8月28日1.將待檢標本和抗原參考品作適當稀釋。（二）操作方法2.將待測標本和標準抗原溶液（5個濃度抗原標準品）與適當過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測定各管吸光度。

3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。第十頁，共四十三頁，2022年，8月28日待測的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。抗原抗體復(fù)合物數(shù)量足夠多。具有充分的反應(yīng)時間，只能測定抗原抗體反應(yīng)的第二階段。高親和力的抗體，并保證抗體過量。（三）技術(shù)要求

第十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日（四）方法評價

優(yōu)點:靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準確

不足:

①抗體用量較大；②溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大③透射比濁測定在抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測需在抗原抗體反應(yīng)達到平衡后進行，耗時較長。

第十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)。二、免疫散射比濁法(一)原理第十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日不同大小的微粒形成的散射光分布不同。當微粒直徑小于入射光的波長的十分之一時，散射光的強度在各個方向的分布均勻一致，稱Rayleighae散射。當微粒直徑大于或等于入射光的波長時，前向散射光遠遠強于后向散射光，稱Mile散射。第十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日第十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。當固定檢測角度與發(fā)射光的波長時，散射光的強度與復(fù)合物的含量成正比，即待測的抗原越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強。第十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日

應(yīng)選擇適當?shù)墓庠磸姸?、反?yīng)時間、測量角度及光源的波長。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強度、pH值等。(二)技術(shù)要求第十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動態(tài)測定方法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1～2min即可完成。

(三)速率散射比濁法（ratenephelometry）第十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日累計時間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020

抗原抗體復(fù)合物形成時間與速率的關(guān)系第十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日當抗體的濃度固定于一定范圍時，復(fù)合物形成的速率峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時間的延長，免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時間出現(xiàn)。通過微機處理即可得到待測蛋白成份的含量。第二十頁，共四十三頁，2022年，8月28日第二十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日

速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時間與抗體濃度及純度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力交高的試劑。此外，要保證待測樣本血清的性狀符合要求，如嚴重脂血等即為不合格樣本。技術(shù)要求第二十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日(三)方法評價散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精密等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴,對抗體的質(zhì)量要求很高。第二十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。三、免疫膠乳比濁法（一）原理：第二十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日三、免疫膠乳比濁法（一）原理：第二十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)自動化免疫比濁分析第二十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日（一）BN特種蛋白分析測定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測定方法是透射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標準曲線進行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測定原理第二十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日系統(tǒng)由分析儀、計算機、條碼讀取器、打印機四部分組成，其中分析儀是主要組成部分，包括散射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運輸裝置和比色杯裝置。

2.儀器基本組成第二十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日BNⅡ、BN100特種蛋白分析分析系統(tǒng)第二十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過量的前提下，光束通過抗原抗體復(fù)合物時所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測抗原的濃度。1.測定原理（二）ARRAY分析系統(tǒng)第三十頁，共四十三頁，2022年，8月28日ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測濁儀、40孔樣本轉(zhuǎn)盤、20孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動器等組成。2.儀器基本組成第三十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日Array360、IMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)第三十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日二、免疫比濁分析的主要影響因素1．抗原抗體比例抗原抗體比例要適當。2．抗體的純度與效價診斷試劑應(yīng)盡可能選擇高純度與高效價的抗體。3．免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性溶液中免疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容易相互聚集。第三十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日4．增聚劑利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進反應(yīng)的進行。5.離子強度PBS是較好的反應(yīng)液。返回章目錄第三十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日抗原過量檢測

(1)抗體適當過量

(2)對抗原過量進行閾值限定第三十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日第三十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日

免疫比濁分析法主要用于特定蛋白系列檢測。如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。

三、臨床應(yīng)用第三十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日小結(jié)

經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體反應(yīng)的終點進行結(jié)果判斷，存在操作繁瑣、費時、敏感度低及難以自動化等缺陷。自動化免疫比濁分析儀器的問世解決了以上的諸多問題。第三十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日目前，透射免疫比濁法和散射免疫比濁等方法已常規(guī)運用于臨床特定體液蛋白質(zhì)的檢測，相關(guān)儀器已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)各級醫(yī)院，成為臨床免疫檢測的重要手段之一。返回章目錄第三十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日思考題

1.名詞解釋：透射免疫比濁法、散射免疫比濁法2.免疫比濁分析的基本原理是什么？有哪些類型？3.簡述免疫比濁分析的主要影響因素。第四十頁，共四十三頁，2022年，8月28日一、選擇題1.速率散射比濁法之所以能比傳統(tǒng)的沉淀反應(yīng)試驗大大地縮短時間，主要是因為A.在抗原抗體反應(yīng)的第一階段判定結(jié)果B.不需復(fù)雜的儀器設(shè)備C.使用低濃度的瓊脂或瓊脂糖D.反應(yīng)的敏感度高第四十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.透射免疫比濁法A.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中IC反射的光的強度B.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中IC折射的光的強度C.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中IC吸收的光的強度D.測定光線通過反應(yīng)混合液時，透過的光的強度3.散射免疫比濁法檢測的原理A.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中IC反射的光的強度B.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中IC折射的光的強度C.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中IC吸收的光的強度D.測定光線通過反應(yīng)混合液時，透過的光的強度第四十二頁，共四十三頁，2