免疫沉淀試驗(yàn)

免疫沉淀試驗(yàn)第一頁，共七十六頁，2022年，8月28日第六章免疫沉淀試驗(yàn)第二頁，共七十六頁，2022年，8月28日

教學(xué)目的掌握：液相內(nèi)沉淀試驗(yàn)、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)原理熟悉：沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)、免疫電泳技術(shù)、沉淀反應(yīng)的應(yīng)用第三頁，共七十六頁，2022年，8月28日

一、基本原理免疫沉淀反應(yīng)（immunoprecipitationreaction）指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié)免疫沉淀試驗(yàn)的基本原理第四頁，共七十六頁，2022年，8月28日形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見第五頁，共七十六頁，2022年，8月28日環(huán)狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測定免疫擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)二、免疫沉淀試驗(yàn)的分類第六頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.階段性2.特異性3.抗原性質(zhì)：可溶性4.抗體的選擇：2價

三、免疫沉淀試驗(yàn)的特點(diǎn)第七頁，共七十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)液體免疫沉淀試驗(yàn)第八頁，共七十六頁，2022年，8月28日一、絮狀免疫沉淀試驗(yàn)絮狀免疫沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。第二節(jié)液體免疫沉淀試驗(yàn)第九頁，共七十六頁，2022年，8月28日抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例一、絮狀免疫沉淀試驗(yàn)第十頁，共七十六頁，2022年，8月28日1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉示意圖淀AgAbAg第十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日最適比方陣測定法抗體稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—第十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日

原理：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時，在增濁劑中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。

二、免疫濁度測定第十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好、簡便快速，易于自動化敏感度高精確度高無放射性核素污染第十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.根據(jù)反應(yīng)的時間和反應(yīng)結(jié)合的動力學(xué)分為速率比濁法終點(diǎn)比濁法2.根據(jù)檢測儀器的位置及光信號性質(zhì)分為透射免疫比濁法散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分類：第十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日

透射比濁試驗(yàn)和散射比濁試驗(yàn)光路檢測器A檢測器BIC

I0

Iθ

Iθ

透射比濁試驗(yàn)

散射比濁試驗(yàn)當(dāng)復(fù)合物＜3×106dal，I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量。第十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日（1）抗原抗體的比例：反應(yīng)體系保持抗體過量（2）抗體的質(zhì)量：特異性強(qiáng)，效價高，親和力強(qiáng)，并使用R型抗體（3）抗原抗體反應(yīng)液的環(huán)境：最適PH為6.5-8.5（4）增濁劑補(bǔ)充：免疫濁度測定影響因素第十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日（1）抗原抗體的比例第十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日

在抗體過量的反應(yīng)體系中,抗原量的遞增與比濁定量成正比,當(dāng)抗原抗體比例合適時反應(yīng)達(dá)峰值,而當(dāng)抗原過量時,形成的免疫復(fù)合物分子小,濁度反而下降的一個拋物曲線。海德堡曲線第十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日（2）抗體的質(zhì)量抗體的特異性抗體的效價(>1:20)抗體的親和力R型和H型抗體（R型）第二十頁，共七十六頁，2022年，8月28日（3）抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境最適PH為：離子強(qiáng)度大，IC形成快離子種類的影響，常用磷酸鹽緩沖液（4）增濁劑PEG(6000—8000)濃度4%吐溫-20第二十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.抗血清中有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分2.增濁劑濃度和反應(yīng)時間掌握不當(dāng)3.樣品本身的濁度處理不當(dāng)4.試劑污染變質(zhì)5.比色杯不夠清潔偽濁度形成的原因第二十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)第二十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)第二十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日

可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。

原理第二十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日反應(yīng)介質(zhì)：凝膠凝膠的特點(diǎn)：1、固相的液體2、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3、Ag-Ab復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)在凝膠中第二十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日原理：抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點(diǎn)：1.制板2.打孔3.加樣4.擴(kuò)散

5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量試驗(yàn)一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第二十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣放置37℃

24～48h觀察沉淀環(huán)一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第二十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日第二十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日

T1為16-24h；T2為24-48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線

t1為16-24h；t2為24-48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線第三十頁，共七十六頁，2022年，8月28日待檢蛋白質(zhì)抗原須具備的條件僅針對某待測抗原的單價特異性抗血清已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品待測品含量在1.25g/ml以上第三十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日單向擴(kuò)散試驗(yàn)上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第三十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白的檢測第三十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日技術(shù)要點(diǎn)：

1.制板

2.打孔

3.加樣

4.擴(kuò)散二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第三十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日第三十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日第三十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.判斷抗原或抗體的存在以及估計(jì)相對含量2.分析抗原或抗體相對分子量二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第三十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日3.分析抗原的性質(zhì)二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第三十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日第三十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日4.滴定抗體的效價5.鑒定抗原或抗體純度二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第四十頁，共七十六頁，2022年，8月28日

應(yīng)用

1.AFP檢測的最早方法

2.血清中含量較高的酶類、細(xì)菌病毒感染后血清中產(chǎn)生的抗體的檢測第四十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日三、免疫電泳技術(shù)第四十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日

優(yōu)點(diǎn)：

1.加快反應(yīng)的速度。

2.提高了靈敏度。

3.增加了分辨率。電泳分析＋沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量三、免疫電泳技術(shù)第四十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日電泳（electrophoresis）：在外加電場的作用下帶電顆粒向著其電性相反的電極移動，稱為電泳。

第四十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日電泳遷移率：定義：同一電場條件下，各種帶電粒子在單位時間內(nèi)移動的距離。M=cm2/VS影響泳動的速度的因素:

本身凈電荷量、顆粒大小、形狀電場強(qiáng)度溶液pH值溶液離子強(qiáng)度電滲第四十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日電滲：電場中液體相對于固體的運(yùn)動

①載體的性質(zhì)

②緩沖液的離子強(qiáng)度

③電泳時的電壓第四十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日電滲方向與樣品運(yùn)動方向一致：樣品遷移率加快電滲方向與樣品運(yùn)動方向不一致：樣品遷移率降低，甚至倒退

第四十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日電泳載體：瓊脂瓊脂糖凝膠

常用濃度：0.8%-1.0%

特點(diǎn):雜質(zhì)少、接近電中性，常溫易凝固，色澤透明、質(zhì)地均勻、富有彈性。第四十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)：

--NH2

+H2O

--NH3++OH---COOH--COO-+H+

兩性離子pH=pI電中性，無電泳移動性pH<pI酸性溶液帶正離子，向陰極泳動pH>pI堿性溶液帶負(fù)離子，向陽極泳動第四十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日原理：雙向擴(kuò)散+電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴(kuò)散技術(shù)比雙向擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度提高8～16倍（一）對流免疫電泳第五十頁，共七十六頁，2022年，8月28日通電－蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場中向正極移動抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動

＋（一）對流免疫電泳第五十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日第五十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日結(jié)果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。（一）對流免疫電泳第五十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日技術(shù)評價：

1.簡便、快速,敏感度較雙擴(kuò)提高8-16倍，可測蛋白質(zhì)濃度達(dá)ug/ml.2.要求抗原、抗體比例嚴(yán)格3.不適宜抗原抗體都是球蛋白的檢測第五十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日

抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。

單向免疫擴(kuò)散＋電泳,定量檢測技術(shù)（二）火箭免疫電泳第五十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)，6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測樣品濃度。技術(shù)要點(diǎn)（二）火箭免疫電泳第五十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日

火箭免疫電泳圖①②③④為標(biāo)準(zhǔn)抗原；⑤⑥為標(biāo)本-+（二）火箭免疫電泳示意圖第五十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日結(jié)果判定：

1、定性：直接觀察、染色2、定量：根據(jù)峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3、為提高靈敏度，可加入少量125I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰第五十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日原理：區(qū)帶電泳＋雙向擴(kuò)散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進(jìn)行雙向擴(kuò)散（三）免疫電泳第五十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日根據(jù)各蛋白所處的電泳位置,可分為:白蛋白區(qū)、球蛋白區(qū)、1區(qū)、2區(qū)、區(qū)、區(qū)

+--ALB12白蛋白抗胰蛋白酶觸珠蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白IgG前白蛋白酸糖蛋白銅藍(lán)蛋白C3aC3bCRP1脂蛋白抗糜蛋白酶巨球蛋白第六十頁，共七十六頁，2022年，8月28日第六十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日第六十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.純化抗原和抗體成分的分析2.正常及異常免疫球蛋白的識別與鑒定應(yīng)用免疫電泳第六十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日-+（三）免疫電泳示意圖第六十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日第六十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日技術(shù)評價：

1.分辨率較高2.僅定性3.擴(kuò)散時間長，影響因素多，結(jié)果較難分析4.目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別與鑒定。第六十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型原理區(qū)帶電泳＋沉淀反應(yīng)（四）免疫固定電泳第六十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日

左圖為IgGκ型,中圖為IgGλ型，右為正常

SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ（四）免疫固定電泳示意圖第六十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日原理：

待檢蛋白電泳

固定劑及各類抗血清加于凝膠表面的泳道