免疫膠體金銀技術(shù)

免疫膠體金銀技術(shù)第一頁，共三十頁，2022年，8月28日

免疫金技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史1971年膠體金應(yīng)用于免疫組化1978年免疫金技術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞表面抗原1981年免疫金銀法1986年彩色免疫金銀法第二頁，共三十頁，2022年，8月28日免疫膠體金銀技術(shù)

一、免疫金技術(shù)二、免疫金銀法三、彩色免疫金銀法四、免疫金和免疫金銀法的優(yōu)點(diǎn)五、免疫金銀法染色中常見的問題及對(duì)策六、免疫膠體鐵技術(shù)第三頁，共三十頁，2022年，8月28日一、免疫金技術(shù)膠體金：金的水溶液，具有一般溶膠特性。膠體金制備：化學(xué)還原法；在一定濃度的金溶液中加入一定量的還原劑使金離子變成金原子（氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)）。膠體金顏色：用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。5-20nm葡萄酒紅20-40nm深紅色60nm橙黃色還原劑：白磷、乙醇、過氧化氫、枸櫞酸鈉、鞣酸等膠體金標(biāo)記：實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。膠體金顆粒與蛋白質(zhì)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。此外，還可與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合。

第四頁，共三十頁，2022年，8月28日(2)試劑

容器:酸處理洗凈配制試劑:雙蒸餾水或三蒸餾水氯化金水溶液的配制：1g的氯化金溶解于雙蒸水中配成l％的水溶液；4℃冰箱內(nèi)保存。白磷配制：在雙蒸水中切塊，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密閉保存

不需硅化處理可直接制備膠體金。為了減少了金顆粒的吸附作用，也可用已制備的同等大小顆粒的膠體金溶液包被玻璃器皿表面，棄去，再用雙蒸水洗凈。流水沖洗；清潔液浸泡24h；自來水洗凈清潔液；洗潔劑洗3～4次；自來水沖洗；蒸餾水洗3～4次；雙蒸水把每個(gè)器皿洗3～4次；烤箱干燥后備用。1制備膠體金的準(zhǔn)備（1）玻璃器皿的清潔第五頁，共三十頁，2022年，8月28日2膠體金的制備白磷還原法、抗壞血酸還原法、檸檬酸三鈉還原法、檸檬酸鈉—鞣酸還原法、乙醇超聲波還原法、硼氫化鈉還原法、放射性膠體金制備法常用的方法:2種(1)檸檬酸三鈉還原法制備程序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。制備膠體金時(shí)金顆粒的大小與檸檬酸三鈉用量成反比。操作步驟：1）1mll％氯化金加入100ml蒸餾水中，煮沸。2）迅速加入4mll％檸檬酸鈉，保持沸騰狀態(tài)，攪動(dòng)至出現(xiàn)透明的橙紅色。3）自來水沖洗燒瓶，冷卻。第六頁，共三十頁，2022年，8月28日(2)檸檬酸鈉—鞣酸還原法特點(diǎn)：通過改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，且顆粒的直徑均勻一致，適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。

操作步驟：1）根據(jù)所需的膠體金顆粒分別配制A液和B液。2）將配制好的A、B兩液在水浴內(nèi)加熱到60℃，保持溫度穩(wěn)定。3）在電磁攪拌器上攪拌A液迅速加入B液，加熱7～10min至膠體金變成葡萄酒色。4)用自來水沖洗燒瓶，使之迅速冷卻。原理：檸檬酸三鈉——主要為還原劑。鞣酸——還原、保護(hù)作用，決定膠體金顆粒大小形成。

第七頁，共三十頁，2022年，8月28日制備膠體金時(shí)都應(yīng)注意以下各點(diǎn)：①所有溶液均應(yīng)用雙蒸水配制②檸檬酸鈉與鞣酸溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配③用于制備膠體金的燒瓶硅化需處理④在清潔干燥的燒瓶中加入少許1％硅油，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，使硅油均勻鋪展于燒瓶?jī)?nèi)壁，傾出多余硅油。燒瓶置烤箱內(nèi)烘干。

上述步驟可重復(fù)2～3次第八頁，共三十頁，2022年，8月28日3蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記

原理：

PH值等于或稍偏堿性的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)表面張力最大，處于微弱的水化狀態(tài)，能牢固吸附于金顆粒表面，形成蛋白層，阻止膠體金顆粒相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)；

PH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與膠體金顆粒負(fù)電荷相互排斥不能結(jié)合。穩(wěn)定劑：牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明膠第九頁，共三十頁，2022年，8月28日（1）待標(biāo)記蛋白質(zhì)準(zhǔn)備透析除鹽除去蛋白質(zhì)內(nèi)多余電解質(zhì)，過高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的電位，影響蛋白質(zhì)吸附。方法:蛋白質(zhì)置于透析袋直接放入雙蒸水或極低濃度鹽水透析去除蛋白沉淀低溫保存的蛋白質(zhì)或抗體易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過程及免疫金探針的穩(wěn)定性有影響，標(biāo)記前離心除去聚合物。待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定量的測(cè)定光電比色法、目測(cè)法（2）膠體金PH值調(diào)整標(biāo)記前將膠體金溶液的PH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿第十頁，共三十頁，2022年，8月28日

（3）蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記

（1）根據(jù)標(biāo)記膠體金的總量計(jì)算所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。（2）在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至PI超過0.5pH），逐滴加入蛋白質(zhì)，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。（3）加入5%的牛血清白蛋白使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇使其終濃度為0.05%,前者穩(wěn)定膠體金的效果好于后者。（4）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋，扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮到原體積的1/10量，后純化。離心法純化時(shí)，不要濃縮。第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日

（4）膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化目的：除去未標(biāo)記蛋白、未標(biāo)價(jià)膠體金、聚合物。方法：高速與超速離心法、凝膠過濾法

1）高速與超速離心法

1）將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液高速離心機(jī)離心15min，吸上清，棄沉淀，去除大的聚合物。2）小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以TBS溶解，重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于TBS中。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10-30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集。第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日

2)凝膠過濾法

特點(diǎn)：簡(jiǎn)便，顆粒比較均勻，不易凝集，克服了離心方法膠體金顆粒易凝集的弱點(diǎn)。必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。操作過程：1）濃縮的膠體金離心取上清2）加樣體積為柱狀體積的1/103)丙烯葡萄糖S-400裝柱，TBS平衡層析柱4）TBS洗脫，注意顏色變化。第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日（5）免疫金染色法1978年，首次應(yīng)用免疫金探針檢測(cè)B淋巴細(xì)胞表面抗原，建立了用于光鏡水平的免疫金法（IGS）。特點(diǎn)：染色程序簡(jiǎn)便，不要顯色;能檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原。要求:金顆粒的直徑大于20nm，且濃度較高。一般都采用間接法。第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日（1）石蠟切片→脫蠟至水。（2）胰蛋白酶消化或尿素消化。（3）用雙蒸水振洗5＇×2。（4）用0.02mol/lTBSpH8.2振洗10＇×2。（5）1%卵蛋白（EA）封閉10min。（6）稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體（TBS），4℃過夜。（7）0.02mol/lTBSpH8.2振洗10＇×2。（8）1%EA封閉10min。

IGS的步驟（人肝組織HBsAg的定位為例)：（9）TBS稀釋兔抗鼠金標(biāo)抗體。（10）TBS振洗.（11）雙蒸水振洗5＇×2。（12）1%戊二醛，10min。（13）雙蒸水5min。（14）用蘇木素襯染核，甘油封片。結(jié)果：光鏡下部分肝細(xì)胞漿內(nèi)有金顆粒聚集呈紅色，表明有HBsAg定位在細(xì)胞漿內(nèi)。第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日(6)蛋白A-金（PAG）放大法在IGS方法定位細(xì)胞抗原時(shí)可用搭橋法，使IGS得到放大.

抗A蛋白抗體作橋的PAG放大法(以5-羥色胺定位為例):

（1）石蠟切片→脫蠟至水。（2）胰蛋白酶消化或尿素消化。（3）TBS洗5＇×2。（4）1%EA封閉組織。（5）用TBS稀釋兔抗5-羥色胺抗體,4℃過夜，或者37℃1h。（6）TBS振洗5＇×2。第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日（7）1%EA封閉10min。（8）用0.05mol/lpH7.4TBS稀釋PAG.（9）0.05mol/lpH7.4TBS振洗10＇×2。（10）1%EA封閉10min。（11）抗A蛋白抗體（1：100）37℃45min。（12）0.05mol/lpH7.4tbs振洗10‘×2。（13）加0.05mol/lpH7.4TBS稀釋PAG（1：40）。（14）0.05mol/lpH7.4TBS振洗10＇×2。（15）雙蒸水振洗5min。（16）1%戊二醛10min。（17）雙蒸水振洗5min。（18）0.01%伊文思藍(lán)2min，甘油封片。第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日結(jié)果：光鏡下觀察，小腸粘膜內(nèi)含有嗜銀顆粒的細(xì)胞胞漿呈紅色，陽性顆粒位于細(xì)胞核底部，比單純用PAG染色深度得到加深，陽性結(jié)果得到放大。原理：抗A蛋白抗體Fab段、Fc段均可與PAG上的A蛋白結(jié)合，因此，聚集更多的膠體金顆粒。PAG放大法的優(yōu)點(diǎn)：①使用試劑單一；②敏感性高；③背景干凈。第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日

二、免疫金銀法（IGSS）原理:將1GS與銀顯影方法相結(jié)合,沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著催化劑的作用，使顯影液中的銀離子在還原劑(對(duì)苯二酚)存在的情況下被還原為銀原子，在金顆粒周圍形成一個(gè)“銀殼”，由于金顆粒的液化作用，使更多的銀離子被還原，“銀殼”增大，最后使抗原位置得以放大。第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日1硝酸銀顯影液的配制

(1)10％明膠液+枸櫞酸緩沖液+對(duì)苯二酚+蒸餾水，混合，磁力攪拌均勻(注意避光)，用前加入硝酸銀水溶液

(2)Ph3.5枸櫞酸緩沖液：枸櫞酸+枸櫞酸三鈉+雙蒸水2操作步驟(1)組織固定后，5％、10％和20％系列濃度的蔗糖處理，制作冰凍切片，厚10～30gm；(2)含l％正常羊血清或1％BSA的PBS室溫孵育20分鐘，封閉抗體非特異性結(jié)合部位；(3)含1％氫硼化鈉的PBS孵育20分鐘；(4)第一抗體孵育，可先置4度，12～18小時(shí)，然后室溫1小時(shí)，使抗體充分滲透并結(jié)合；

第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日

(5)PBS漂洗3次，每次5分鐘；

(6)0.1％BSA／PBS液(pH8．2)漂洗5分鐘，為膠體金結(jié)合提供堿性環(huán)境；

(7)膠體金標(biāo)記的第二抗體(pH8.2)室溫孵育30～45分鐘，摸索最佳稀釋

(8)硝酸銀液避光處理2—10分鐘，顯影時(shí)間最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定；

(9)解剖顯微鏡下選取免疫反應(yīng)陽性部位。1％Os04后固定30分鐘，雙蒸水漂洗；

(10)組織標(biāo)本的脫水、樹脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等方法同前述。結(jié)果：光鏡下見陽性黑色狀顆粒，背景干凈。第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日5nmSPA膠體金電鏡觀察

SPA膠體金標(biāo)記I型單純皰疹病毒(HSV-1)抗原免疫電鏡

人胚肺細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞漿中病毒囊膜及其鄰近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的病毒抗原結(jié)合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金顆粒，他們的外周區(qū)域可見大量的金顆粒聚集第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日

三、彩色免疫金銀法（CIGSS）

基本原理：是在IGSS基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新方法，與彩色顯影相似。

IGSS方法染色在抗原位點(diǎn)處生成銀顆粒被氧化成溴化銀，后者被彩色顯影劑還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其產(chǎn)物變成有色的染料沉積在銀顆粒的部位。由于染料只能通過彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以不與組織發(fā)生非特異性吸附。第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日

1操作步驟

(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，依次用胰蛋白酶，Lugol’s碘液，硫代硫酸鈉處理，TBS漂洗。

(2)1％卵蛋白10min。

(3)適當(dāng)稀釋的特異性抗體，37℃孵育或4℃過夜。

(4)TBS漂洗后，與1％卵蛋白作用10min。

(5)適當(dāng)稀釋的金標(biāo)二抗，37℃lh。

(6)TBS漂洗5min；雙蒸水漂洗5min。

(7)物理顯影。

(8)自來水沖洗后，雙蒸水漂洗5min。(9)2％鐵氰化鉀和1％溴化鉀作用Imin，雙蒸水漂洗。(10)彩色顯影液顯影，雙蒸水漂洗。(11)依次加入2％鐵氰化鉀和1％溴化鉀溶液作用lmin。(12)2％硫代硫酸鈉和1％弧硫酸鈉溶液作用5min。(13)自來水沖洗后，緩沖甘油封片。陽性物質(zhì)呈藍(lán)色(α-萘酚為成色劑)或綠色(菲尼酮為成色劑)第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日四、免疫金法和免疫金銀法的優(yōu)點(diǎn)：①制備簡(jiǎn)單；②標(biāo)記簡(jiǎn)單：抗體、凝集素、酶、SPA、激素等易通過物理吸附作用與膠體金顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物。標(biāo)記過程不需要任何化學(xué)方法交聯(lián)，抗體的生物活性可保持不變，標(biāo)記過程容易；③適用范圍：光鏡、熒光顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡、X線能譜分析;④特異性強(qiáng)：免疫金探針的非特異性吸附作用小，較少受生物組織背景因素影響；⑤敏感性高：金顆粒電子密度大—適合電鏡，檢測(cè)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酶反應(yīng)物，提高分辨率金顆粒經(jīng)過銀顯影后得到放的，檢測(cè)抗原的敏感性比PAP高200倍適合檢測(cè)石蠟切片標(biāo)本中的微弱抗原第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日五、免疫金銀法染色中常見的問題及對(duì)策（一）背景染色產(chǎn)生的原因1一抗或金標(biāo)抗體濃度過高，降低其濃度2使用正常血清封閉和在抗體稀釋液中加入BSA，可減少非特異吸附；3顯色器皿必須徹底清洗，化學(xué)試劑須用三蒸水配置；4乳酸銀和硝酸銀的顯色在避光環(huán)境，醋酸銀則在有光的環(huán)境中顯色；5顯色時(shí)切片應(yīng)垂直放置在銀顯影液中；6控制反應(yīng)時(shí)間，顯影液中加入適量的阿拉伯膠或明膠可延緩反應(yīng)速度，避免過度的還原銀非特異吸附在切片上。25℃10-15分，《20℃20-30分7洗滌：使用TBS時(shí)最好加入TritonX或Tween80，可洗脫非特異吸附的污染蛋白質(zhì)第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）背景染色已發(fā)生如何消除

12%硫代硫酸鈉、1%鐵氰化鉀對(duì)半混合，加在切片上至背景無色為止；22%鐵氰化鉀、1%溴化鉀混合作用1min水沖洗，然后加2%硫代硫酸鈉和1%亞硫酸鈉脫色，至背景干凈為止；30.1%重鉻酸鉀加入0.25%濃硫酸，在顯微鏡下控制脫色時(shí)間，至陽性結(jié)果清楚，