基因工程的基本條件全

生物工程專業(yè)核心課程基

因

工

程基因工程5

2

3

4

1

6

7

8

9

基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動物基因工程高等植物基因工程3基因工程的基本條件C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶A用于核酸操作的工具酶3基因工程的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生生的平平頭末末端5‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G……3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C……5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性性核酸酸內(nèi)切切酶II型限制制性核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶酶解解反應(yīng)應(yīng)的操操作大部分分II型核酸酸內(nèi)切切酶需需要相相似的的反應(yīng)應(yīng)條件件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶酶100mM中鹽酶酶150mM高鹽酶酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶的酶酶活性性：在在最佳佳反應(yīng)應(yīng)條件件下反反應(yīng)1小小時時，完完全水解1mg標準DNA所需的的酶量量限制性性核酸酸內(nèi)切切酶II型限制制性核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶酶解解反應(yīng)應(yīng)的操操作II型核酸酸內(nèi)切切酶的的多酶酶聯(lián)合合酶解解：對鹽濃濃度要要求相相同的的酶，，原則則上可可以同同時酶酶切，，但應(yīng)應(yīng)注意意：5‘……GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘……CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘……GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘……CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘……GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘……CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性性核酸酸內(nèi)切切酶II型限制制性核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶酶解解反應(yīng)應(yīng)的操操作II型核酸酸內(nèi)切切酶的的多酶酶聯(lián)合合酶解解：對鹽濃濃度要要求不不同的的酶，，可采采取下下列方方法：：使用較較貴的的酶的的鹽濃濃度，，加大大便宜宜酶的的用量量，同同時酶酶解低鹽酶酶先切切，然然后補補加鹽鹽，高高鹽酶酶再切切一種酶酶先切切，然然后更更換緩緩沖液液，另另一種種酶再再切0.1倍體積積的5MNaAcpH5.42.5倍體積積的冰冰冷乙乙醇冰浴5分分鐘鐘、高高速冷冷凍離離心10分分鐘、、干燥燥限制性性核酸酸內(nèi)切切酶影響限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶活活性的的因素素DNA樣品的的純度度：蛋白質(zhì)質(zhì)、苯苯酚、、氯仿仿、乙乙醇、、EDTA、、SDS、、NaCl等加大酶酶的用用量，，1mgDNA用10U酶加大反反應(yīng)總總體積積延長反反應(yīng)時時間限制性性核酸酸內(nèi)切切酶影響限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶活活性的的因素素DNA樣品的的甲基基化程程度：：大腸桿桿菌中中的dam甲基化化酶在在5‘GATC3’序列中中的腺腺嘌呤N6位引入甲甲基，，受其其影響響的酶酶有BclI、MboI等，但但BamHI、、BglII、、Sau3AI不受影影響大腸桿桿菌中中的dcm甲基化化酶在在5‘CCAGG3’’或5‘CCTGG3’’序列中的胞嘧啶啶C5位上引入入甲基基，受其影影響的的酶有有EcoRII等哺乳動動物中中的甲甲基化化酶在在5‘CG3’序列中中的C5位上引入入甲基基限制性性核酸酸內(nèi)切切酶影響限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶活活性的的因素素核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶的緩緩沖液液性質(zhì)質(zhì)：高濃度度的酶酶、高高濃度度的甘甘油、、低離離子強強度、、極端端pH值等，會使一一些核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶的識識別和和切割割序列列發(fā)生生低特特異性性，即即所謂的的Staractivity現(xiàn)象EcoRI在正常常條件件下識識別并并切割割5‘‘GAATTC3’序列，，但在在甘油濃度度超過過5%（v/v）時，也也可切切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’DNA連接酶DNA連接酶的的基本性性質(zhì)修復(fù)雙鏈鏈DNA上缺口處處的磷酸酸二酯鍵鍵DNA連接酶5‘……G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘……C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘……G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘……C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的的基本性性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的的DNA鏈上缺口口處的磷磷酸二酯酯鍵T4-DNA連接酶5‘……G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A3‘……C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘……G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’’3‘……C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的的基本性性質(zhì)連接多個個平頭雙雙鏈DNA分子：5‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶的的反應(yīng)條條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的的酶活性性：在最最佳反應(yīng)應(yīng)條件下下15℃反應(yīng)1小時時，完全連接接1mgl-DNA（HindIII片段）所所需的酶酶量DNA連接酶平頭雙鏈鏈DNA片段的連連接操作作從分子動動力學(xué)的的角度講講，由限限制性核核酸內(nèi)切切酶創(chuàng)造造的粘性性末端的的連接屬屬于分子子內(nèi)部的的連接，，而平頭頭末端的的連接則則屬于分分子間的的連接，，因此后后者反應(yīng)應(yīng)速度要要慢得多多提高平頭頭末端連連接效率率的方法法包括：：加大連接接酶用量量（10倍大于粘粘性末端端的連接接）加大平頭頭末端底底物的濃濃度，增增加分子子間碰撞撞機會加入10%PEG8000，促進大分分子之間間的有效效作用加入單價價陽離子子（NaCl），最終濃度度150-200mMDNA聚合酶大腸桿菌菌DNA聚合酶I（DNApolI））5‘→3‘的DNA聚合酶活活性5‘→3‘的核酸外外切酶活活性3‘→5‘的核酸外外切酶活活性大腸桿菌菌DNA聚合酶I的基本性性質(zhì)：3‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘……C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌菌DNA聚合酶I（DNApolI））缺口前移移標記法法大腸桿菌菌DNA聚合酶I的基本用用途：5‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP））5‘……G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A……5‘‘5‘‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T……3’’3‘‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A……5‘‘Nicktranslation制備備32P標記記的的探探針針DNaseIDNApolIDNA聚合合酶酶大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本性性質(zhì)質(zhì)：：大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I經(jīng)枯枯草草桿桿菌菌蛋蛋白白酶酶處處理理，，獲獲得得N端三分分之之二二的的大大肽肽段段，，即即為為Klenow酶Klenow酶仍仍擁擁有有5‘‘→→3‘‘的DNA聚合合酶酶活活性性和3‘‘→→5‘‘的核核核酸酸外外切切酶酶活活性性，但但失失去去了了5‘‘→→3‘‘的核核酸酸外外切切酶酶活活性性DNA聚合合酶酶大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本用用途途：：補平平由由核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶產(chǎn)產(chǎn)生生的的5‘‘粘粘性性末末端端DNA片段段的的同同位位素素末末端端標標記記cDNA第二二鏈鏈的的合合成成雙脫脫氧氧末末端端終終止止法法測測定定DNA序列列DNA聚合合酶酶大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本用用途途：：補平平由由核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶產(chǎn)產(chǎn)生生的的5‘‘粘粘性性末末端端5‘‘……G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C……5’’KlenowdATPdTTP5‘‘……G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C……5’’DNA聚合合酶酶大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本用用途途：：DNA片段段的的同同位位素素末末端端標標記記5‘‘……G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C……5’’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘‘……G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C……5’’DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶T4-DNA酶的的基基本本特特性性：：在無無dNTP時，，可可以以從從任任何何3‘‘-OH端外外切切在只只有有一一種種dNTP時，，外外切切至至互互補補核核苷苷酸酸暴暴露露時時停停止止在四四種種dNTP均存存在在時時，，聚聚合合活活性性占占主主導(dǎo)導(dǎo)地地位位5‘‘→→3‘‘的DNA聚合合酶酶活活性性和和3‘‘→→5‘‘的核核酸酸外外切切酶酶活活性性DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶的的基基本本用用途途：：切平平由由核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶產(chǎn)產(chǎn)生生的的3’粘性性末末端端5‘‘……G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C……5’’T4-DNA聚合合酶酶5‘‘……G-C-T-C-OHP-G-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-G-PHO-C-C-T-C……5’’注意意：：該該酶酶也也能能降降解解雙雙鏈鏈DNA，只是是其其活活性性比比單單鏈鏈降降解解活活性性低低很很多多DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶的的基基本本用用途途：：DNA片段段的的同同位位素素末末端端標標記記5‘‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’’3‘‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘‘Mg2+5‘‘pppdN5‘‘pppdA（（a-32P-dATP））5‘‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘‘T4-DNApolT4-DNApol5‘‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’’3‘‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘‘DNA聚合合酶酶依賴賴于于RNA的DNA聚合合酶酶（（反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶））反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶的的基基本本特特性性：：以RNA為模模板板聚聚合合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’’mRNA反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’’cDNADNA聚合合酶酶依賴賴于于RNA的DNA聚合合酶酶（反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶的的基基本本特特性性：：雙向向外外切切DNA-RNA雜合合鏈鏈中中的的RNA鏈反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶3’’RNA5’’DNA3’’5’’3’’RNA5’’DNA3’’5’’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’核酸酶單鏈核酸外切切酶：核酸外外切酶VII（ExoVII））大腸桿菌的核核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶雙鏈核酸外切切酶：核酸外外切酶III（ExoIII））ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核核酸外切酶III特異性地從3‘端外切切核酸酶雙鏈核酸外切切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特特異性地從5‘端外切切3’5’3’5’核酸酶單鏈核酸內(nèi)切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本本特性：來自自稻谷曲霉菌菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解解單鏈RNA快7倍核酸酶單鏈核酸內(nèi)切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶單鏈核酸內(nèi)切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或或切口的雙鏈鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶單鏈核酸內(nèi)切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈鏈外切的核酸酸酶：Bal31核酸酶S1核酸酶的基本本特性：來自自艾氏交替單單胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈鏈外切的核酸酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本本用途：誘發(fā)發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC核酸修飾酶末端脫氧核苷苷酰轉(zhuǎn)移酶（（TdT）TdT的基本特性：：來自小牛胸胸腺不需要模板的的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘TdT的基本特性：：5‘p3‘HOOH3‘‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘‘p5‘AAAAAAAAAAA核酸修飾酶堿性磷酸單酯酯酶來自小牛胸腺腺的堿性磷酸酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌菌的堿性磷酸酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘5‘HO5‘HOdN5‘HON核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+pppATP（（g-32P-ATP））5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探針的末末端同位素標標記：B用于基因克隆隆的載體3基因工程的基基本條件質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載載體載體的功能及及特征載體的功能及及特征載體的功能運送外源基因因高效轉(zhuǎn)入受受體細胞為外源基因提提供復(fù)制能力力或整合能力力為外源基因的的擴增或表達達提供必要的的條件載體的功能及及特征載體應(yīng)具備的的條件具有針對受體體細胞的親緣緣性或親和性性（可轉(zhuǎn)移性性）具有合合適的的篩選選標記記具有較較高的外外源DNA的載裝裝能力力具有多多種單單一的的核酸酸內(nèi)切切酶識識別切切割位位點具有與與特定定受體體細胞胞相適適應(yīng)的的復(fù)制制位點點或整整合位位點質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒是是生物物細胞胞內(nèi)固固有的的、能能獨立立于寄寄主染染色體體而自自主復(fù)復(fù)制、、并被穩(wěn)定定遺傳傳的一一類核核酸分分子質(zhì)粒常常見于于原核核細菌菌和真真菌中中絕大多多數(shù)的的質(zhì)粒粒是DNA型的絕大多多數(shù)的的天然然DNA質(zhì)粒具具有共共價、、封閉閉、環(huán)環(huán)狀的的分子子結(jié)構(gòu)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子子量范范圍：：1-300kb質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒的的自主主復(fù)制制性質(zhì)粒能能利用用寄主主細胞胞的DNA復(fù)制系系統(tǒng)進進行自自主復(fù)復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)復(fù)制子子結(jié)構(gòu)構(gòu)決定定了質(zhì)質(zhì)粒與與寄主主的對對應(yīng)關(guān)關(guān)系根據(jù)在在每個個細胞胞中的的分子子數(shù)（（拷貝貝數(shù)））多寡寡，質(zhì)質(zhì)?？煽煞譃闉閮纱髲?fù)復(fù)制類類型：：嚴緊型型復(fù)制制控制制的質(zhì)質(zhì)粒1-3拷拷貝stringentplasmid松弛型型復(fù)制制控制制的質(zhì)質(zhì)粒10-60拷拷貝stringentplasmid質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒的的自主主復(fù)制制性：：拷貝數(shù)數(shù)的控控制機機制––質(zhì)質(zhì)粒粒DNA復(fù)制啟啟動控控制控制復(fù)復(fù)制引引物與與模板板的結(jié)結(jié)合oriE.coliColE1plasmid復(fù)制方方向rop（+））RopRNAIIRNAI3’5’5’3’質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒的的自主主復(fù)制制性：：拷貝數(shù)數(shù)的控控制機機制––質(zhì)質(zhì)粒粒DNA復(fù)制啟啟動控控制控制復(fù)復(fù)制起起始因因子與與復(fù)制制起始始位點點（ori）的結(jié)合合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒的的不相相容性性任何兩兩種含含有相相似復(fù)復(fù)制子子結(jié)構(gòu)構(gòu)的不不同質(zhì)質(zhì)粒，，不能能同時時存在在于一個細細胞中中，這這種現(xiàn)現(xiàn)象稱稱為質(zhì)粒的的不相相容性性，不相相容性性的質(zhì)質(zhì)以大腸腸桿菌菌的質(zhì)質(zhì)粒為為例：：ColE1、pMB1擁有相相似的的復(fù)制制子結(jié)結(jié)構(gòu)，，彼此此不相相容pSC101、、F、、RP4擁有相相似的的復(fù)制制子結(jié)結(jié)構(gòu)，，彼此此不相相容p15A及其衍衍生質(zhì)質(zhì)粒擁擁有相相似的的復(fù)制制子結(jié)結(jié)構(gòu)，，彼此此不相相容粒組成成不相容容性群群質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒的的不相相容性性：分子機機制兩種含含有相相似復(fù)復(fù)制子子結(jié)構(gòu)構(gòu)的不不同質(zhì)質(zhì)粒，，在復(fù)復(fù)制時時受到到同一一種拷貝數(shù)數(shù)控制制系統(tǒng)統(tǒng)的干干擾，，致使使兩種種質(zhì)粒粒的最最終拷拷貝數(shù)數(shù)不同同，兩種含含有不不同復(fù)復(fù)制子子結(jié)構(gòu)構(gòu)的不不同質(zhì)質(zhì)粒，，在復(fù)復(fù)制時時各受受自己己的拷貝數(shù)數(shù)控制制系統(tǒng)統(tǒng)的調(diào)調(diào)節(jié)，，致使使兩種種質(zhì)粒粒的最最終拷拷貝數(shù)數(shù)恒定定，因此在在經(jīng)過過若干干復(fù)制制周期期和細細胞分分裂周周期后后仍能能共處處于同同一細胞內(nèi)內(nèi)其中拷拷貝數(shù)數(shù)多的的質(zhì)粒粒在以以后的的細胞胞分裂裂周期期中更更具優(yōu)優(yōu)勢質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征質(zhì)粒的的可轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移性性革蘭氏氏陰性性菌的的質(zhì)粒?？煞址殖蓛蓛纱箢愵悾航雍闲托唾|(zhì)粒粒能在天天然條條件下下自發(fā)發(fā)地從從一個個細胞胞轉(zhuǎn)移移到另一個個細胞胞（接接合作作用）），如如F、Col、R質(zhì)粒等等如Col、R的其它它成員員非接合合型質(zhì)質(zhì)粒不能在在天然然條件件下獨獨立地地發(fā)生生接合合作用用值得注注意的的是，，某些些非接接合型型質(zhì)粒粒（ColE1）在接合合型質(zhì)質(zhì)粒的存在在和協(xié)協(xié)助下下，也也能發(fā)發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，，這個個過程程由bom和mob基因決決定質(zhì)粒質(zhì)粒的的基本本特征征攜帶特特殊的的遺傳傳標記記野生型型的質(zhì)質(zhì)粒DNA上往往往攜帶帶一個個或多多個遺遺傳標標記基基因，，這使得寄寄主生生物產(chǎn)產(chǎn)生正正常生生長非非必需需的附附加性性狀，，包括括：物質(zhì)抗抗性抗生素素、重重金屬屬離子子、毒毒性陰陰離子子、有有機物物物質(zhì)合合成抗生素素、細細菌毒毒素、、有機機堿這些標標記基基因?qū)NA重組分分子的的篩選選具有有重要要意義義質(zhì)粒質(zhì)粒的的構(gòu)建建天然存存在的的野生生型質(zhì)質(zhì)粒由由于分分子量量大、、拷貝貝數(shù)低低、單單一酶酶切位位點少少、遺遺傳標標記不不理想想等缺缺陷，，不能能滿足足克隆隆載體體的要要求，，因此此往往往需要要以多多種野野生型型質(zhì)粒粒為基基礎(chǔ)進進行人人工構(gòu)構(gòu)建。。目前實實驗室室使用用的大大腸桿桿菌質(zhì)質(zhì)粒大大多是是由少少數(shù)幾幾個野野生型型質(zhì)粒粒構(gòu)建建的：：pSC1018.8kb拷貝數(shù)數(shù)5四四環(huán)環(huán)素抗抗性標標記基基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)數(shù)20-30大大腸腸桿菌菌內(nèi)毒毒素標標記基基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)質(zhì)粒氨氨芐青青霉素素抗性性標記記基因因Apr質(zhì)粒質(zhì)粒的的分類類人工構(gòu)構(gòu)建的的質(zhì)粒粒根據(jù)據(jù)其功功能和和用途途可分分成如如下幾幾類：：高拷貝貝質(zhì)粒粒突變拷拷貝數(shù)數(shù)控制制基因因拷拷貝貝數(shù)1000-3000擴擴增增基因因低拷貝貝質(zhì)粒粒來自pSC101拷貝數(shù)數(shù)小于于10表達某某些毒毒性基基因溫敏質(zhì)質(zhì)粒在不同同溫度度下表表現(xiàn)出出拷貝貝數(shù)、、整合合等不不同性性質(zhì)測序質(zhì)質(zhì)粒含有測測序通通用引引物互互補序序列和和多酶酶接頭頭polylinker整合質(zhì)質(zhì)粒裝有整整合促促進基基因及及位點點便便于于外源源基因因的整整合穿梭質(zhì)質(zhì)粒裝有針針對兩兩種不不同受受體的的復(fù)制制子便便于基基因克克隆表達質(zhì)質(zhì)粒裝有強強化外外源基基因表表達的的轉(zhuǎn)錄錄、翻翻譯、、純化化的元元件探針質(zhì)質(zhì)粒裝有報報告基基因便便于啟啟動子子等元元件的的克隆隆篩選選質(zhì)粒重要的的大腸腸桿菌菌質(zhì)粒粒載體體松弛型型復(fù)制制pBR322：：氯霉素素可擴擴增拷貝數(shù)數(shù)50-100/cell用于基基因克克隆質(zhì)粒重要的的大腸腸桿菌菌質(zhì)粒粒載體體pUC18/19：：拷貝數(shù)數(shù)2000-3000/cell用于基基因克克隆和和測序序裝有多多克隆隆位點點（MCS）正選擇擇顏色色標記記lacZ’’質(zhì)粒重要的的大腸腸桿菌菌質(zhì)粒粒載體體pUC18/19：：正選擇擇標記記lacZ’’的顯色色原理理pUC18/19PlaclacZ’’MCSb-半乳糖糖苷酶酶的a-肽段ab5-溴-4-氯氯-3-吲吲哚基基-b-D-半乳糖糖苷X-gal質(zhì)粒重要的的大腸腸桿菌菌質(zhì)粒粒載體體pGEM-3Z：多拷貝貝裝有兩兩個噬噬菌體體的強強啟動動子裝有多多克隆隆位點點（MCS）正選擇擇顏色色標記記lacZ’’用于外外源基基因的的高效效表達達注意：：T7和SP6啟動子子特異異性地地由噬噬菌體體DNA編碼的的RNA聚合2743bpMCSlacZ’’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識識別，，因此此相應(yīng)應(yīng)的受受體菌菌必須須表達達噬菌菌體RNA聚合酶酶，如如：E.coliBL21（（DE3））等質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離離純化化實驗室室一般般使用用下列列三種種方法法制備備質(zhì)粒粒DNA：氯化銫銫密度度梯度度離心心法質(zhì)粒DNA純度高高、周周期長長、設(shè)設(shè)備要要求高高、溴溴乙錠錠污染染堿溶法法質(zhì)粒DNA純度底底、快快速、、操作作簡便便沸水浴浴法質(zhì)粒DNA純度、、操作作周期期介于于氯化化銫法法和堿堿溶法法之間間質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離離純化化氯化銫銫密度度梯度度離心心法：：用含有有EDTA的緩沖沖液懸懸浮菌菌體加溶菌菌酶裂裂解細細菌細細胞壁壁加CsCl和溴乙乙錠超速離離心過過夜在紫外外燈下下吸取取cccDNA稀釋沉沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離離純化化堿溶法法：用含有有EDTA的緩沖沖液懸懸浮菌菌體加溶菌菌酶裂裂解細細菌細細胞壁壁加NaOH和SDS的混合合溶液液，去去膜釋釋放內(nèi)內(nèi)含物物加高濃濃度的的醋酸酸鉀溶溶液，，沉淀淀染色色體，，去除除染色體DNA及大部部分蛋蛋白質(zhì)質(zhì)離心取取上清清液，，用苯苯酚-氯仿仿萃取取，去去除痕痕量的的蛋白白質(zhì)乙醇或或異丙丙醇沉沉淀水水相質(zhì)質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘殘余的的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純純化沸水浴法法：用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液液懸浮菌菌體加溶菌酶酶裂解細細菌細胞胞壁沸水浴40秒鐘鐘離心，用用無菌牙牙簽挑去去沉淀物物乙醇或異異丙醇沉沉淀質(zhì)粒粒DNA噬菌體或或病毒DNA噬菌體或或病毒是是一類非非細胞微微生物，，能高效效率高特特異性地地侵染宿主細胞胞，然后后或自主主復(fù)制繁繁殖，或或整合入入宿主基基因組中中潛伏起來，而而且在一一定的條條件下上上述兩種種狀態(tài)還還會相互互轉(zhuǎn)化。。噬菌體或或病毒的的上述特特性使得得它們的的DNA能被開發(fā)發(fā)成為基基因工程的有用用載體，，因為：：高效率的的感染性性能使外外源基因因高效導(dǎo)導(dǎo)入受體體細胞自主復(fù)制制繁殖性性能使外外源基因因在受體體細胞中中高效擴擴增噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl噬菌體的的生物學(xué)學(xué)特性：：生物結(jié)構(gòu)構(gòu)l噬菌體是是大腸桿菌菌的溫和和型噬菌菌體l噬菌體由外殼包包裝蛋白白和l-DNA組成l-DNA全長48502個核苷酸酸l-DNA上至少有61個基基因l噬菌體生生物學(xué)特特性：生物結(jié)構(gòu)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成成基因尾部合成成基因溶菌控制制基因晚期控制制基因DNA合成控制制基因阻遏基因因早期控制制基因阻遏基因因重組基因因刪除與整整合基因因l-DNA噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl噬菌體生生物學(xué)特特性：感染周期期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl噬菌體生生物學(xué)特特性：感染周期期體內(nèi)包裝裝100個個左右的的拷貝包裝范圍圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl噬菌體生生物學(xué)特特性：溶原狀態(tài)態(tài)l噬菌體感感染大腸腸桿菌后后，除能能裂解細細胞外，，也可能能將其DNA直接整合合到宿主主細胞的的染色體體DNA上，并不不產(chǎn)生子子代噬菌菌體顆粒粒，這種種情況為為溶原狀態(tài)態(tài)。整合主主要由l-DNA上的cI和int兩基因的的產(chǎn)物所所激活，，而這兩兩個基因因的開放放與關(guān)閉閉又取決決于宿主主細胞本本身的性性質(zhì)。人人們可以以根據(jù)需需要改變變l-DNA或宿主細細胞的性性質(zhì)，使使噬菌體體或處于于溶菌狀態(tài)態(tài)，或處于于溶菌狀狀態(tài)DNA重組技術(shù)術(shù)一般需需要l噬菌體進進入溶菌菌狀態(tài)噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：縮短長度度野生型l-DNA包裝的上上限為51kb，本身長度度為48.5kb，只有當插插入的外外源DNA片段不大大于2.5kb時，才能被被包裝成成有感染染力的噬噬菌體顆顆粒。因因此縮短短野生型型l-DNA的長度，，可以提提高裝載載量。其其實野生生型l-DNA上約有40-50%的片段是是復(fù)制和和裂解所所非必需需的。根根據(jù)切除除的多少少，可將將l-DNA分成兩大大類載體體：插入型載載體取代型載載體噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：縮短長度度插入型載載體體外包裝裝插入位點點體外包裝裝插入片段段載體長度度37kb插入片段段大小：：0-14kb（51––37）噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：縮短長度度取代型載載體體外包裝裝體外包裝裝插入片段段最小裝載載長度10kb（51––26）載體長度度26kb插入片段段最大裝載載長度25kb（36––26）噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：刪除重復(fù)復(fù)的酶切切位點野生型的的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不不利于重組組操作，，必須刪刪除至1-2個同時，為為了便于于各種來來源的DNA片段的克克隆，還還需要增增加一些單一的的酶切位位點除了簡單單的切割割外，還還需要采采用定點點突變技技術(shù)去除除或增添添酶位點噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：加裝選擇擇標記與質(zhì)粒不不同，野野生型l-DNA上缺少合合適的選選擇標記記，因此此加裝選擇標記記是l-DNA克隆載體體構(gòu)建的的重要內(nèi)內(nèi)容l-DNA克隆載體體上的選選擇標記記主要有有下列兩兩類：免疫功能能類標記記顏色反應(yīng)應(yīng)類標記記噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：加裝選擇擇標記imm434imm434基因編碼碼一種阻阻止l-噬菌體進入溶菌菌循環(huán)的的阻遏物物。含有有完整標標記基因的l-載體進入入受體細細胞后，，建立溶溶原狀態(tài)，，細菌生生長緩慢慢，形成成渾濁斑斑；當外源DNA插入到標標記基因因中，基基因滅活，l-重組分子子便進入入溶菌循循環(huán)，形形成透明斑噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：加裝選擇擇標記lacZlacZ基因編碼碼b-半乳糖苷苷酶，能能催化無色的X-gal生成藍色色化合物物。當外外源基因插入到到lacZ基因中，，基因滅滅活，不不能合成藍色色化合物物；而空空載體l-DNA則產(chǎn)生藍色透透明斑噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：構(gòu)建琥珀珀密碼子子的突變變體琥珀型突突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。。大腸桿桿菌的某某些菌株株含有特特異性的的校正基基因，其其編碼產(chǎn)產(chǎn)物校正正tRNA能專一性性地糾正正這一突突變。將野野生生型型l-DNA上D和E兩個個頭頭部部包包裝裝蛋蛋白白的的基基因因中中的的CAG密碼碼子子突突變變成成UAG。當這這種種l-DNA進入入一一般般的的大大腸腸桿桿菌菌菌菌株株后后，，不不能能合合成成有有活活性性的的頭頭部部蛋蛋白白，，也也就就不不能能被被包包裝裝和和裂裂解解細細菌菌，，這這樣樣就就可可以以阻阻止止有有害害重重組組體體的的生生物物污污染染及及擴擴散散，，而而基基因因工工程程實實驗驗中中使使用用的的受受體體則則是是具具有有琥琥珀珀型型突突變變體體校校正正功功能能的的菌菌株株噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA載體體的的主主要要類類型型：：插入入滅滅活活型型載載體體Charon2、、Charon6、、lgt11取代代型型載載體體lEMBL4、、lgtlc、、lNM762、、Charon40正選選擇擇型型載載體體lEMBL1、、lL47、、l1059野生生型型的的l噬菌菌體體不不能能在在P2噬菌菌體體溶溶源源性性的細細菌菌中中繁繁殖殖（（Spi+），，這種種生生長長抑抑制制表表型型受受l-DNA上的的red和gam兩個個基基因因控控制制。。若若將將外外源DNA取代代red和gam，重組組噬菌菌體體便便擁擁有有Spi-表型型，，能能在在P2噬菌菌體溶源源性性的大大腸腸桿桿菌菌受受體體菌菌中中繁繁殖殖，，并并形形成成透透明明斑斑噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA重組組分分子子的的體體外外包包裝裝：：l-DNA重組組分分子子需需在在體體外外人人工工包包裝裝成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌體體重重組組顆顆粒粒，，方方可可高高效效導(dǎo)導(dǎo)入入受受體體細細胞胞用于于體體外外包包裝裝的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)可可直直接接從從感感染染了了l噬菌菌體體的的大大腸腸桿桿菌菌中中提提取取，，現(xiàn)現(xiàn)已已商商品品化化。。這這些些包包裝裝蛋蛋白白通通常常分分為為相相互互互互補補的的兩兩部部分分：：一一部部分分缺缺少少E組份份，，另另一一部部分分則則缺缺少少D組份份。。包包裝裝時時，，當當且且僅僅當當這這兩兩部部分分包包裝裝蛋蛋白白與與重重組組l-DNA分子子混混合合后后，，包包裝裝才才能能有有效效進進行行，，任任何何一一種種蛋蛋白白包包裝裝液液被被重重組組l-DNA污染染后后，，均均不不能能被被包包裝裝成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌體體顆顆粒粒，，這這也也是是基基于于安安全全而而設(shè)設(shè)計計的的噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA及其其重重組組分分子子的的分分離離純純化化：：將大大腸腸桿桿菌菌在在含含有有麥麥芽芽糖糖的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中培培養(yǎng)養(yǎng)至至對對數(shù)數(shù)生生長長期期加入入l噬菌菌體體或或重重組組l噬菌菌體體的的懸懸浮浮液液，，37℃培培養(yǎng)養(yǎng)1小時時用新新鮮鮮培培養(yǎng)養(yǎng)基基稀稀釋釋，，繼繼續(xù)續(xù)培培養(yǎng)養(yǎng)4-12小時時。。這這時時噬噬菌菌體體顆顆粒粒密度度已已達達1013-1014/L，大腸腸桿桿菌菌細細胞胞已已完完全全裂裂解解超速速離離心心，，沉沉淀淀噬噬菌菌體體苯酚酚抽抽提提，，釋釋放放l-DNA乙醇醇或或異異丙丙醇醇沉沉淀淀l-DNA噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA作為為載載體體的的優(yōu)優(yōu)點點：：l-DNA可在在體體外外包包裝裝成成噬噬菌菌體體顆顆粒粒，，能能高高效效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染大大腸腸桿桿菌菌l-DNA載體體的的裝裝載載能能力力為為25kb，遠遠遠大大于于質(zhì)質(zhì)粒粒的的裝裝載載量量重組組l-DNA分子子的篩篩選選較較為為方方便便重組組l-DNA分子子的的提提取取較較為為簡簡便便l-DNA載體體適適合合克克隆隆和和擴擴增增外外源源DNA片段段，，但但不不適適合合表表達達外源源基基因因噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的M13單鏈鏈噬噬菌菌體體DNAM13噬菌菌體體的的生生物物學(xué)學(xué)特特性性：：生物物結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)M13噬菌菌體體的的外外型型呈呈絲絲狀狀M13噬菌菌體體由外外殼殼包包裝裝蛋蛋白白和和正鏈DNA組成成M13DNA全長長6407個核核苷苷酸酸M13DNA上至少少有有10個個基基因因2700個個外外殼殼蛋蛋白白分分子子M13噬菌菌體體不裂裂解解宿宿主主細細胞胞，，但但抑抑制制其其生生長長噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的M13單鏈鏈噬噬菌菌體體DNAM13噬菌菌體體的的生生物物學(xué)學(xué)特特性性：：感染染周周期期+DNA（+））DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的M13單鏈鏈噬噬菌菌體體DNAM13DNA載體體的的構(gòu)構(gòu)建建：：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生生型型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列列載載體體lacZ‘‘polylinker噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的M13單鏈鏈噬噬菌菌體體DNAM13DNA載體體的的特特點點：：使克克隆隆的的DNA片段段以以特特定定單單鏈鏈的的形形式式輸輸出出受受體體細細胞胞外外這在在DNA定向向突突變變中中非非常常有有用用M13重組組分分子子篩篩選選簡簡便便被M13噬菌菌體體感感染染的的受受體體細細胞胞生生長長緩緩慢慢，，形形成成混混濁斑斑，，易易于于辨辨認認挑挑選選。。而而且且重重組組分分子子越越大大，，混混濁濁斑的的混混濁濁度度亦亦越越大大但M13-DNA載體體的的最最大大缺缺陷陷是是裝裝載載量量小小，，只只有有1.5kb噬菌菌體體或或病病毒毒DNA與動動植植物物受受體體細細胞胞相相適適應(yīng)應(yīng)的的載載體體一一般般選選擇擇相相應(yīng)應(yīng)動動植植物物的的病病毒基基因因組組DNA。動植植物物病病毒毒種種類類繁繁多多，，每每一一種種動動植植物物都都有有多多種種特特異異性性的的病病毒。按照照基因組組的結(jié)構(gòu)構(gòu)，可將將動植物物病毒分分成四大大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自自我復(fù)制制時大多多存在相相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)應(yīng)物，這些中間間體可作作為載體體進行常常規(guī)的DNA重組?？妓官|(zhì)粒粒與噬菌菌粒l-DNA載體和M13-DNA載體的裝裝載量最最大分別別為25kb和1.5kb，但在很多多情況下下，往往往需要克隆更大大的外源源DNA片段，考斯質(zhì)粒粒和噬菌菌粒載體體的構(gòu)建建就是為為了進一一步提高高噬菌體體DNA的裝載量量。在包裝上上限固定定的條件件下，大大幅度縮縮短噬菌菌體DNA的長度，，就能同步步增加載載體的裝裝載能力力。將噬噬菌體DNA與包裝有有關(guān)的序序列與質(zhì)粒粒組裝在在一起，，既能最最大限度度地縮短短載體的的長度，，同時又能保證證重組DNA分子在體體外仍被被包裝成成有感染染力的顆顆粒，這這便是構(gòu)建建考斯質(zhì)質(zhì)粒和噬噬菌粒載載體的思思路。當當然，由由于考斯斯質(zhì)粒和噬菌粒粒不再攜攜帶包裝裝蛋白基基因，因因此重組組DNA分子在細細胞內(nèi)不能形成成噬菌體體顆粒。?？妓官|(zhì)粒粒與噬菌菌?？妓官|(zhì)粒粒（cosmid））考斯質(zhì)粒粒載體的的構(gòu)建：：考斯質(zhì)粒粒是一類類人工構(gòu)構(gòu)建的含含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制制子的特殊類型型的載體體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍圍為31-45kb考斯質(zhì)粒粒與噬菌菌?？妓官|(zhì)粒粒（cosmid））考斯質(zhì)粒粒載體的的特點：：能像l-DNA那樣進行行體外包包裝，并并高效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染受體體細胞裝載量大大（45kb）且克隆片片段具有有一定的的大小范范圍能像質(zhì)粒粒那樣在在受體細細胞中自主復(fù)復(fù)制重組操作作簡便，，篩選容容易不能體內(nèi)內(nèi)包裝，，不裂解解受體細胞胞考斯質(zhì)粒粒與噬菌菌粒噬菌粒（（phagemidorphasmid）噬菌粒載載體的特特點：噬菌粒是是一類人人工構(gòu)建建的含有有單鏈噬噬菌體包裝序列列、復(fù)制制子以及質(zhì)粒復(fù)制制子、克克隆位點點、標記記基因的的特殊類類型的載載體能像M13-DNA那樣體外外包裝，，并高效效轉(zhuǎn)染受受體細胞胞裝載量比比常規(guī)的的M13mp系列要大大很多（（10kb）能像質(zhì)粒粒那樣在在受體細細胞中自主復(fù)復(fù)制重組操作作簡便，，篩選容容易通過克隆隆雙鏈DNA能獲得同同等長度度的單一一單鏈DNA考斯質(zhì)粒粒與噬菌菌粒噬菌粒（（phagemidorphasmid）重要的噬噬菌粒載載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌菌體DNA考斯質(zhì)粒粒與噬菌菌粒噬菌粒（（phagemidorphasmid）重要的噬噬菌粒載載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟啟動子PT3和PT7強化外源基因的的轉(zhuǎn)錄提取出來來的單鏈鏈DNA重組分子子在噬菌體體RNA聚合酶的的存在下，又又可實現(xiàn)現(xiàn)外源基基因的體外轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄人造