基因的重組與轉(zhuǎn)移

外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章

基因的重組與轉(zhuǎn)移

一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)DNA片段的體外連接1.兩段DNA的連接依靠粘性末端2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端ligasenick二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒(méi)有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段段連接起來(lái)不能把插入片片段再切下來(lái)來(lái)。非酶切位點(diǎn)用T4DNA連接酶連到平平端DNA上，然后再用用酶切，形成成一個(gè)人工粘粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法法合成的一段段10-12bp的特定限制性性內(nèi)切酶識(shí)別別位點(diǎn)序列的的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切切酶把插入片片段切下來(lái)。。如果插入片段段內(nèi)部也有該該酶位點(diǎn)，不不能切下完整整的插入片段段2）能給載體連連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)學(xué)的吳瑞教授授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，，直接成為人人工粘性末端端。①adapter一頭平末端、、另一頭粘性性末端（某種種酶切位點(diǎn)序序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接頭自我連接接接頭與接頭會(huì)會(huì)彼此以粘性性末端接在一一起，影響與與DNA片段的連接。。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，，水解掉其5’端的磷酸，防防止自我連接接。（以后再用T4多核苷酸激酶酶加上磷酸。））⑤防止自我連連接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’’接頭之間不能能形成磷酸二二酯鍵自我連連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’’HO-GGCC-p5’’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’’HO-GGCC5’’缺口口缺口口HO--OHCIP處理理T4ligase雖然然有有缺缺口口，，但但仍仍然然能能與與DNA片片斷斷連連接接。。三、、PCR產(chǎn)物物的的連連接接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切切位點(diǎn)符合載體的的多克隆位位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則則（2）帶酶切位位點(diǎn)的引物物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切切酶的識(shí)別別序列。（5’端多多余的3~5bp屬屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)內(nèi)部酶切位位點(diǎn)重復(fù)。。引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’GCAGAATTC互補(bǔ)序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3-’5’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互補(bǔ)序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列-5’3’-引物2帶酶切位點(diǎn)點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTCPCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGPCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一一個(gè)粘性末末端！2.與T載體直接連連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一一個(gè)多余的的核苷酸（（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)個(gè)3’端人為地各各加一個(gè)T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)當(dāng)原料中只只有dTTP時(shí)，被迫在在平端載體體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA四、DNA體外連接應(yīng)應(yīng)注意的事事項(xiàng)插入片斷與與載體的酶酶切位點(diǎn)互互補(bǔ)相同的粘性性末端才能能有效地連連接。盡量避免平平端連接。。決不能進(jìn)行行非粘性末末端連接。。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的的酶切（2）用同尾酶酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘粘性末端。。2.DNA插入的方向向正確（1）用雙酶切切由于產(chǎn)生的的粘性末端端不同，只只能以固定定方向連接接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的的開(kāi)放閱讀讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的的時(shí)候，更更要注意。。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變變！4.防止載體自自身環(huán)化連連接（1）提高插入入片斷的用用量連接反應(yīng)體體系中，插插入片斷比比載體多10倍以上。（2）用堿性磷磷酸酶處理理載體載體切口的的5’磷酸被除去去，不能自自我連接。。但可以與與插入片斷斷以單鏈連連接。5’3’載體插入入片片斷斷1.載體體自自身身環(huán)環(huán)化化連連接接（（能能存存活活））2.載體之間間互相連連接（能能存活））3.插入片段段互相連連接（不不能存活活）4.一個(gè)載體體與幾個(gè)個(gè)插入片片段重組組（能存存活）五、載體體和外源源DNA插入片段段的連接接結(jié)果5.幾個(gè)載體體與一個(gè)個(gè)插入片片段重組組（能存存活）171.目的增加受體體菌細(xì)胞胞膜的通通透性。。第二節(jié)重組體導(dǎo)導(dǎo)入細(xì)菌菌細(xì)胞一、感受受態(tài)大腸腸桿菌的的制備使用喪失失了限制體系系的大腸桿桿菌。如如K12系列的大大腸桿菌菌。2.菌種用CaCl2處理大腸腸桿菌，，能增加加膜的通通透性。。3.制備原理理4.制備過(guò)程程培養(yǎng)大腸腸桿菌OD600至Onice5-10min4℃離心收收集菌用冰冷的的60mMCaCl2重懸4℃離心收收集菌4℃離心收收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的的60mMCaCl2重懸二、重組組DNA導(dǎo)入大腸腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（（transformation)大腸桿菌菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。。（2）轉(zhuǎn)染（（transfection)大腸桿菌菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌菌的幾種種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌菌的過(guò)程程。每gDNA轉(zhuǎn)化成功功的細(xì)菌菌克隆數(shù)數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法法2.轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化化效率不不高（106-108/gDNA）。（1）熱休休克法法（heatshock）轉(zhuǎn)化效效率高高（高高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法法10ng載體DNA100L感受態(tài)態(tài)菌Onice混合，，靜置置10分鐘42ooC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液液涂含含抗菌菌素的的平板板吸附DNA攝入DNA（1）熱休休克法法LB培養(yǎng)受受體菌菌至OD600冰浴15分鐘，，2°C離心集集菌冰冷的的水重重懸菌菌體2°C離心集集菌冰冷的的水重重懸菌菌體2°C離心收收集菌菌體少量冰冰冷的的水重重懸分裝成成50-300L電轉(zhuǎn)儀儀調(diào)為為2.5kV,25F脈沖控控制器器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液液37°C中速震震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液液涂含含抗菌菌素的的平板板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法法4.平板培培養(yǎng)基基培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)菌菌10-100L轉(zhuǎn)化液液涂于含含抗菌菌素的的平板板37℃過(guò)夜夜環(huán)形重重組質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒自自我連連接線性載載體或或DNA片片斷進(jìn)進(jìn)入細(xì)細(xì)菌會(huì)會(huì)被降降解。。①環(huán)形質(zhì)質(zhì)粒數(shù)數(shù)（1）重組組質(zhì)粒粒5.影響轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率率的因因素①生長(zhǎng)長(zhǎng)狀態(tài)態(tài)制備感感受態(tài)態(tài)菌必必須使使用對(duì)對(duì)數(shù)生生長(zhǎng)期期的菌菌。②必須須在冰冰冷的的條件件下制制備。。要充分分，使使細(xì)菌菌細(xì)胞胞膜失失去一一些蛋蛋白。。④儲(chǔ)存存感受受態(tài)菌菌要在在-70℃以下下③CaCl2處理⑤使用用感受受態(tài)菌菌時(shí)必必須迅迅速融融化融化后后一般般不能能再次次凍存存使用用。（2）感受受態(tài)細(xì)細(xì)胞（competentcells)把重組組的噬噬菌體體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成成具有有感染染能力力的噬菌體體顆粒粒。6.體外包包裝的的噬菌菌體的的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)（1）體外外包裝裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)（transduction）通過(guò)受體菌菌細(xì)胞表面面的DNA接受器位點(diǎn)點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外外源基因的的重組體DNA注入受體大大腸桿菌進(jìn)進(jìn)行擴(kuò)增。。cI857基因是個(gè)溫溫度敏感性性阻遏蛋白白基因，感感染細(xì)菌后后，在32℃下培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)菌時(shí)時(shí)能夠保保持溶源源性。但當(dāng)當(dāng)溫溫度度升升高高到到44℃—45℃時(shí)時(shí)，，就就會(huì)會(huì)導(dǎo)導(dǎo)致致cI基因因編編碼碼的的阻阻遏遏蛋蛋白白失失活活，，DNA復(fù)制制、、外外殼殼蛋蛋白白合合成成。。便便于于提提取取外外殼殼蛋蛋白白。。（3）cI857基因突突變的的噬菌體體但由于于該噬噬菌體體的S基因上上有一一個(gè)突突變，，所以以細(xì)菌菌還不不裂解解。cI857其它基基因溶源狀狀態(tài)（（DNA不轉(zhuǎn)錄錄、不不翻譯譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA轉(zhuǎn)錄、、翻譯譯合成成外殼殼蛋白白32℃噬菌體體1外殼蛋蛋白基基因E發(fā)生了了無(wú)義義突變變，不能合合成頭頭部蛋蛋白，但能能合成成其它它外殼殼蛋白白（尾尾部蛋蛋白））。在cI857基因突突變的的噬菌體體的基基礎(chǔ)上上，選選擇兩兩種外外殼蛋蛋白的的突變變型噬菌體體。（4）互補(bǔ)型型噬菌菌體外殼蛋蛋白基基因D發(fā)生了了無(wú)義義突變變，不能合合成頭頭部的的包裝裝識(shí)別別蛋白白，但能能合成成其它它外殼殼蛋白白（頭頭部、、尾部部蛋白白）。。噬菌體體2(5)體外包包裝過(guò)過(guò)程體外包包裝好好的重重組噬噬菌體體感染染受體體菌，，使受受體菌菌發(fā)生生溶菌菌，形形成噬噬菌斑斑。（（每gDNA能形成成106噬菌斑斑）。。（6）轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化率率高的的菌株株；有突變變的菌菌株（（與導(dǎo)導(dǎo)入的的載體體基因因互補(bǔ)補(bǔ)）；；不育的的菌株株（不不會(huì)與與其他他酵母母接合合）。。第三節(jié)節(jié)外源基基因?qū)?dǎo)入真真核細(xì)細(xì)胞一、導(dǎo)導(dǎo)入酵酵母細(xì)細(xì)胞1.菌株選選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用用原生生質(zhì)球球進(jìn)行行轉(zhuǎn)化化2.酵母的的轉(zhuǎn)化化方法法酵母原生質(zhì)質(zhì)體感受態(tài)態(tài)酶去壁壁CaCl2、PEG插入外外源基基因的酵母母載體體PEG（聚聚乙二二醇））使細(xì)胞壁壁具有通通透性性，允允許DNA進(jìn)入入。CaCl2使細(xì)胞膜膜具有通通透性性，允允許DNA進(jìn)入入。轉(zhuǎn)化酵母0.1mol/LLiCl處理插入外外源基基因的的酵母母載體體感受態(tài)態(tài)40%PEG4000（2）利用用Li+鹽進(jìn)行行轉(zhuǎn)化化葉盤(pán)消毒切取土壤農(nóng)農(nóng)桿菌菌浸泡泡看護(hù)培培養(yǎng)基基愈傷組組織分化幼幼苗二、導(dǎo)導(dǎo)入植植物細(xì)細(xì)胞1.葉盤(pán)法法（leafdisk)植物細(xì)細(xì)胞原生質(zhì)質(zhì)體纖維素素酶和和果膠膠酶DNA混合入入電擊擊緩沖沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組組織幼苗分化2.電擊法法（electroporation)又稱高速微微型子子彈射射擊法法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭頭吸附特制手手槍射擊植植物裝入3.基因槍槍法（（genegun）4.膿桿菌菌（agrobacterium）介導(dǎo)導(dǎo)農(nóng)桿菌菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),可可以轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移進(jìn)入入植物基基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens農(nóng)桿菌（agrobacterium）A、Ti質(zhì)質(zhì)粒介導(dǎo)導(dǎo)的整合合轉(zhuǎn)化程程序幾乎所有有的雙子子葉植物物尤其是是豆科類類植物的的根部常常常會(huì)形形成根瘤瘤，這是是由于植植物根部部被一種種革蘭氏氏陰性土土壤桿菌菌農(nóng)桿根瘤菌（（A.tumefaciens）感染所致致，其致致瘤特性性是由該該菌細(xì)胞胞內(nèi)的野生型質(zhì)質(zhì)粒Ti（Tumor-inducing）介導(dǎo)的。。（1）Ti質(zhì)質(zhì)粒的結(jié)結(jié)構(gòu)與功功能TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農(nóng)桿桿菌附著著到植物物細(xì)胞后后，只留留在細(xì)胞胞間隙中中。T-DNA首先在在細(xì)菌中中被加工工、剪切切、復(fù)制制，然后后轉(zhuǎn)入植植物細(xì)胞胞。auxinTi質(zhì)粒粒是根癌癌農(nóng)桿菌菌染色體體外的遺遺傳物質(zhì)質(zhì)，為雙雙股共價(jià)價(jià)閉合的的環(huán)狀DNA分分子，其其分子量量為95～156×106D,約約有200kb組成。。根據(jù)其誘誘導(dǎo)的植植物冠癭癭瘤中所所合成的的冠癭堿堿種類不不同，Ti質(zhì)粒?？梢员槐环殖伤乃姆N類型型：章魚(yú)堿型型(octopine)胭脂堿型型(nopaline)農(nóng)桿堿型型（agropine）農(nóng)桿菌素素堿型（（agrocinopine）或稱稱琥珀堿堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒粒的遺傳傳特性及及類型a、Ti質(zhì)粒粒的圖譜譜整個(gè)質(zhì)粒粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的編碼產(chǎn)產(chǎn)物負(fù)責(zé)責(zé)：合成吲哚哚乙酸t(yī)mr的編碼產(chǎn)產(chǎn)物負(fù)責(zé)責(zé)：合成植物物分裂素素tmt的編碼產(chǎn)產(chǎn)物負(fù)責(zé)責(zé)：合成氨基基酸衍生生物冠癭堿b、Ti質(zhì)粒粒致瘤的的分子機(jī)機(jī)制損傷的植植物根部部會(huì)分泌泌出乙酰酰丁香酸酸和羥基基乙酰丁丁香酸，，它們能能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒粒上的vir基因以及及根瘤菌菌染色體體上的一一個(gè)操縱縱子表達(dá)達(dá)。vir基因產(chǎn)物物將Ti質(zhì)粒上上的T-DNA單鏈切切下，而而根瘤菌菌染色體體上的操操縱子表表達(dá)產(chǎn)物物則與單單鏈T-DNA結(jié)合形形成復(fù)合合物，后后者轉(zhuǎn)化化植物根根部細(xì)胞胞。c、T-DNA的染色色體整合合機(jī)制T-DNA的染染色體整整合機(jī)制制d、Ti質(zhì)粒粒的改造造除去T-DNA上的生生長(zhǎng)素（（tms）和分裂素素（tmr）生物合成成基因，因因?yàn)榇罅康牡纳L(zhǎng)素和和分裂素會(huì)會(huì)抑止細(xì)胞胞再生長(zhǎng)為為整株植物物；除去T-DNA上的的有機(jī)堿生生物合成基基因（tmt）；因?yàn)橛杏袡C(jī)堿的合合成大量消消耗精氨酸酸和谷氨酸酸，影響植植物細(xì)胞的的生長(zhǎng)；安裝大腸桿桿菌復(fù)制子子，使其能能在大腸桿桿菌中復(fù)制制，以利于于克隆操作作；安裝植物細(xì)細(xì)胞的篩選選標(biāo)記，如如neor基因，使用用植物基因因的啟動(dòng)子子和polyA化信信號(hào)序列；；安裝多聚人人工接頭以以利于外源源基因的克克隆。除去Ti質(zhì)粒上上的其它非非必需序列列，最大限限度地縮短短載體的長(zhǎng)長(zhǎng)度；共整合轉(zhuǎn)化化程序二元整合轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蛞蚩寺≡诖蟠竽c桿菌-農(nóng)桿菌穿穿梭質(zhì)粒的的T-DNA區(qū)內(nèi)；；重組質(zhì)粒直直接轉(zhuǎn)化農(nóng)農(nóng)桿菌株，，該菌株攜攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)區(qū)的Ti輔輔助質(zhì)粒；；以上述重組組農(nóng)桿菌感感染植物細(xì)細(xì)胞。binaryTivectorsystemB農(nóng)農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)導(dǎo)的遺遺傳轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化：：轉(zhuǎn)化方方法研研究及及宿主主范圍圍的拓拓展;轉(zhuǎn)化機(jī)機(jī)制研研究;大片段段的DNA轉(zhuǎn)移移;植株原原位轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化（（inplantatransformation).轉(zhuǎn)化方法研研究及宿主主范圍的拓拓展農(nóng)桿菌有嚴(yán)嚴(yán)格的宿主主范圍，它它比較易浸染雙雙子葉植植物，對(duì)單子葉葉植物不不敏感。但近年年來(lái)有一一定進(jìn)展展，農(nóng)桿桿菌在一定條條件下同樣可可以感感染單單子葉葉植物物。利利用農(nóng)農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)導(dǎo)分別別從水水稻、、小麥麥、玉玉米、、甘蔗蔗等獲獲得了了轉(zhuǎn)基基因植植株。。下面面幾個(gè)個(gè)因素素使農(nóng)農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)導(dǎo)轉(zhuǎn)化化單子子葉植植物獲獲得進(jìn)進(jìn)展：：使用酚酚類物物質(zhì)誘誘導(dǎo)vir基因表表達(dá)。。首先發(fā)發(fā)現(xiàn)AS（（乙酰酰丁香香酮））和HO-AS能誘導(dǎo)導(dǎo)vir基基因表表達(dá)，，后來(lái)來(lái)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)鄰苯二二酚40多多類酚酚類物物質(zhì)對(duì)virG有誘誘導(dǎo)活活性。。多種種酚類類復(fù)合合物比比單一一酚類類物質(zhì)質(zhì)的誘誘導(dǎo)活活性更更高。。此外外，較低的的pH、低低于280C的溫溫度、、較高高的滲滲透壓壓、一些些糖類類等均均能誘誘導(dǎo)vir基因表表達(dá)。。轉(zhuǎn)化方方法研研究及及宿主主范圍圍的拓拓展廣寄主主范圍圍農(nóng)桿桿菌菌菌株的的篩選選。主要是是在農(nóng)農(nóng)桿菌菌菌株株的篩篩選、、質(zhì)粒粒載體體的構(gòu)構(gòu)建及及菌株株與載載體的的互作作等方方面進(jìn)進(jìn)行了了大量量工作作。使用單單子葉葉植物物特異異啟動(dòng)動(dòng)子（（如Actin,Ubiquione,andα-Amylase的的啟動(dòng)動(dòng)子代代替35S啟動(dòng)動(dòng)子）和利利用分分生組組織與與農(nóng)桿菌菌共培培養(yǎng)。。目前已已清楚楚決定定農(nóng)桿桿菌與與玉米米的親親和性性的是是農(nóng)桿桿菌的的virA基因，對(duì)該基基因進(jìn)行改造造可望提高農(nóng)農(nóng)桿菌對(duì)單子子葉植物的親親和性。生長(zhǎng)和分裂旺旺盛的胚性愈愈傷組織被認(rèn)認(rèn)為是獲得單單子葉植物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化成功的關(guān)關(guān)鍵因素之一一。轉(zhuǎn)化機(jī)制研究究T-DNA整整合進(jìn)植物基基因組的機(jī)制制比較復(fù)雜，，對(duì)其進(jìn)行研研究有助于建建立轉(zhuǎn)基因新新方法。插入入T-DNA區(qū)的基因本本身與T-DNA的轉(zhuǎn)移移無(wú)關(guān)，僅兩兩側(cè)的25bp同向重復(fù)序列列是必須的,而且右邊界界更重要。其其中14bp是保守的。。整合進(jìn)植物基基因組的T-DNA會(huì)有有一定程度的的缺失、重復(fù)復(fù)、填充和超超界發(fā)生，甚甚至有整個(gè)質(zhì)質(zhì)粒整合進(jìn)基基因組的報(bào)道道。T-DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移主要與vir區(qū)各基基因的協(xié)調(diào)作作用有關(guān)。大片段DNA的轉(zhuǎn)移通常轉(zhuǎn)移的基基因都是一個(gè)個(gè)或幾個(gè)功能能基因，片段段比較?。?lt;30kb)?？墒?，植植物的一些性性狀，如抗病病、抗蟲(chóng)、抗抗逆境、高產(chǎn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等均為為數(shù)量性狀，，或者相關(guān)的的基因往往成成簇排列。這這些性狀的改改造需要一個(gè)個(gè)能將大片段段DNA轉(zhuǎn)入入植物細(xì)胞并并穩(wěn)定表達(dá)的的體系。最近構(gòu)建了一一種新型載體體，它具有細(xì)細(xì)菌人工染色色體（BACs)和農(nóng)桿菌雙元載載體的特點(diǎn)，能轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移大片段DNA。即BiBAC載體，目前在在主要農(nóng)作物物的改良中應(yīng)應(yīng)用還比較困困難，但在水水稻中可以有有效應(yīng)用。功能基因組的的研究要求創(chuàng)創(chuàng)造很多突變變體，需要尋尋求簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因方法。。主要在擬南南芥中應(yīng)用，，大量的植株株抽真空20分鐘，使細(xì)細(xì)菌進(jìn)入植物物細(xì)胞間隙，，或者將花朵朵抽真空讓細(xì)細(xì)菌進(jìn)入，這這種方法避免免了細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)過(guò)程，但轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率不高高。植株原位轉(zhuǎn)化化（inplantatransformation)SAAT:sonication-assistedAgrobacterium-mediatedtransformationTransgenicResearch6,329-336.超聲波生物作作用機(jī)制：超聲波的概念念：頻率高于于人類聽(tīng)覺(jué)上上限頻率(約約20000赫)的聲波波，稱為超聲聲波，或稱超超聲。利用低聲強(qiáng)脈脈沖超聲波的的物理作用，，擊穿細(xì)胞膜膜造成通道，，使外源DNA進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞，，直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞胞，包括有細(xì)胞胞壁的植物細(xì)細(xì)胞。利用超聲波給給植物轉(zhuǎn)化受受體創(chuàng)造大量量的，分布均均勻