分子生物學(xué)L斷裂基因

分子生物學(xué)L斷裂基因第一頁，共八十七頁，2022年，8月28日MolecularBiology

分子生物學(xué)

Lecture3(12Sep,2016,Th,18:00)

GraduateSchoolofChineseAcademyofAgricultural&Sciences(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院)(GSCAAS)第二頁，共八十七頁，2022年，8月28日Chapter2Theinterruptedgene(斷裂基因)第三頁，共八十七頁，2022年，8月28日2.1Introduction 2.2RestrictionendonucleasesareakeytoolinmappingDNA(限制性內(nèi)切核酸酶是DNA作圖中的關(guān)鍵工具(2.3))2.3Organizationofinterruptedgenesmaybeconserved

(斷裂基因的組成結(jié)構(gòu)可能是保守的(2.4))2.4Genescanbeisolatedbytheconservationofexons

(通過外顯子的保守性可以分離基因(2.6))2.5SomeDNAsequencescodeformorethanoneprotein(一些DNA序列編碼一種以上蛋白質(zhì)(2.8)

)2.6Themembersofagenefamilyhaveacommonorganization(基因家族成員具有共同的組織結(jié)構(gòu)(2.11))第四頁，共八十七頁，2022年，8月28日KeyConcepts：Eukaryoticgenomescontaininterruptedgenesthatconsistofanalternationofexons(representedinthefinalRNAproduct)andintrons(removedfromtheinitialtranscript).TheexonsequencesoccurinthesameorderinthegeneandintheRNA,butaninterruptedgeneislongerthanitsfinalRNAproductbecauseofthepresenceoftheintrons.關(guān)鍵概念：真核生物基因組包含的斷裂基因由間隔的外顯子(最終以RNA產(chǎn)物體現(xiàn))和內(nèi)含子(從初始轉(zhuǎn)錄物中去除的序列)組成。外顯子(外元)序列在基因和RNA中的順序是一致的，但由于內(nèi)含子(內(nèi)元)的存在，斷列基因的長度大于它的最終RNA產(chǎn)物的長度。2.1Introduction第五頁，共八十七頁，2022年，8月28日TheexonsarethesequencesrepresentedinthematureRNA.Bydefinition,agenestartsandendswithexons,correspondingtothe5′and3′endsoftheRNA.TheintronsaretheinterveningsequencesthatareremovedwhentheprimarytranscriptisprocessedtogivethematureRNA.外顯子的序列包含在成熟RNA中。也可以是——基因起始、結(jié)束于外顯子——對應(yīng)于RNA的5′和3′端。內(nèi)含子是插入序列，在初始轉(zhuǎn)錄物加工成成熟RNA時被除去。第六頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.1

InterruptedgenesareexpressedviaaprecursorRNA.Intronsareremovedwhentheexonsaresplicedtogether.ThemRNAhasonlythesequencesoftheexons.內(nèi)含子從斷裂基因中去除后形成信使RNA外顯子1剪接去除內(nèi)含子前體mRNA前體RNA(非mRNA)的長度決定基因的區(qū)域每個編碼區(qū)域在基因中是彼此分離的圖2.1

斷裂基因表達(dá)成前體RNA，內(nèi)含子剪切除去后，外顯子剪接連接在一起，而mRNA只有外顯子的序列。第七頁，共八十七頁，2022年，8月28日2.2RestrictionendonucleasesareakeytoolinmappingDNA

(限制性核酸內(nèi)切酶是DNA作圖中的關(guān)鍵工具)(2.3)KeyConcepts?RestrictionendonucleasescanbeusedtocleaveDNAintodefinedfragments.?Amapcanbegeneratedbyusingtheoverlapsbetweenthefragmentsgeneratedbydifferentrestrictionenzymes.關(guān)鍵概念?限制性內(nèi)切核酸酶可以用來將DNA剪切成特定的片段。?用不同的限制性內(nèi)切核酸酶作用，可產(chǎn)生一系列DNA片段，通過疊加方法可用于DNA作圖(物理圖譜)。第八頁，共八十七頁，2022年，8月28日

物理圖譜（PhysicsMap）：物理圖譜描繪DNA上可以識別的標(biāo)記的位置和相互之間的距離(以堿基對的數(shù)目為衡量單位)，這些可以識別的標(biāo)記包括限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，基因等。物理圖譜不考慮兩個標(biāo)記共同遺傳的概率等信息。對于人類基因組來說，最粗的物理圖譜是染色體的條帶染色模式，最精細(xì)的圖譜是測出DNA的完整堿基序列。

物理圖譜是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離［堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)］的圖譜。第九頁，共八十七頁，2022年，8月28日bpisanabbreviationforbasepairs;distancealongDNAismeasuredinbp.

RestrictionenzymesrecognizespecificshortsequencesofDNAandcleavetheduplex(sometimesattargetsite,sometimeselsewhere,dependingontype).bp是堿基對的縮寫；用以測量DNA中的距離。限制性核酸內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA上的特異的短序列并切開雙鏈結(jié)構(gòu)(根據(jù)基因的不同類型，切割可以在靶位點(diǎn)或其它位置)。第十頁，共八十七頁，2022年，8月28日RestrictionmapisalineararrayofsitesonDNAcleavedbyvariousrestrictionenzymes.RestrictionendonucleasescanbeusedtocleaveDNAintodefinedfragments.Amapcanbegeneratedbyusingtheoverlapsbetweenthefragmentsgeneratedbydifferentrestrictionenzymes.限制圖譜是DNA經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶切割后的線性排列。限制性內(nèi)切酶可將DNA切成一定長度的片段。利用由不同限制性內(nèi)切酶切割所產(chǎn)生的片段之間的重疊性質(zhì)可繪制DNA圖譜。第十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.3

FragmentsgeneratedbycleavingDNAwitharestrictionendonucleasecanbeseparatedaccordingtotheirsizes.

圖2.3

限制酶作用產(chǎn)生的DNA切割片段能按照它們的大小而分開。電泳可根據(jù)大小分離片段與對照相比的片段大小對照含有一系列已知大小的片段用限制性核酸內(nèi)切酶切割電泳、與對照DNA對比第十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.4

ArestrictionmapisalinearsequenceofsitesseparatedbydefineddistancesonDNA.ThemapidentifiesthesitescleavedbyenzymesAandB,asdefinedbytheindividualfragmentsproducedbythesingleanddoubledigests.限制圖譜圖2.4

限制圖譜表示的是DNA上以限定長度而分開的所有位點(diǎn)的線性次序。該圖確定了酶A及B的酶切位點(diǎn)，它們由單酶切和雙酶切消化所產(chǎn)生的不同片段來確定。第十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日2.3Organizationofinterruptedgenesmaybeconserved

(斷裂基因的組成結(jié)構(gòu)可能是保守的)(2.4)由于內(nèi)含子額外序列的存在，并通過限制圖譜或電子顯微鏡技術(shù)比較基因與它們的RNA產(chǎn)物而使內(nèi)含子能夠被檢測出來，但最終的定義是通過比較序列而得出的。比較不同生物的同源基因，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的位置通常是保守的，但是相應(yīng)的內(nèi)含子的長度變化可以很大。內(nèi)含子通常不編碼蛋白質(zhì)。第十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.5ComparisonoftherestrictionmapsofcDNAandgenomicDNAformouseβ-globinshowsthatthegenehastwointronsthatarenotpresentinthecDNA.TheexonscanbealignedexactlybetweencDNAandgene.cDNA中缺失內(nèi)含子的限制位點(diǎn)限制位點(diǎn)基因組DNA圖2.5

比較β-珠蛋白的cDNA和基因組DNA的限制圖譜，我們發(fā)現(xiàn)基因有兩個內(nèi)含子而cDNA中則沒有。在cDNA和基因組DNA中，外顯子限制圖譜排列是一致的。第十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.6

AnintronisasequencepresentinthegenebutabsentfromthemRNA(hereshownintermsofthecDNAsequence).Thereadingframeisindicatedbythealternatingopenandshadedblocks;notethatallthreepossiblereadingframesareblockedbyterminationcodonsintheintron.內(nèi)含子序列mRNA中去除阻斷圖2.6

內(nèi)含子就是包含在基因中但在mRNA中缺失的一段序列(此處顯示的是cDNA序列)。讀框用交互開放和陰影區(qū)表示；值得注意的是三個可能的讀框被內(nèi)含子中的終止密碼子所阻斷。第十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.7

Allfunctionalglobingeneshaveaninterruptedstructurewiththreeexons.Thelengthsindicatedinthefigureapplytothemammalianβ-globingenes.

珠蛋白基因具有相似的結(jié)構(gòu)，但內(nèi)含子的長度不同圖2.7

所有功能性珠蛋白基因都是含三個外顯子的斷裂基因結(jié)構(gòu)。圖中標(biāo)識的長度亦適用于哺乳動物β-珠蛋白基因。內(nèi)含子長度包含第十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日UTR（UntranslatedRegions)即非翻譯區(qū)，是信使RNA（mRNA）分子兩端的非編碼片段。

5'-UTR從mRNA起點(diǎn)的甲基化鳥嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密碼子，3'-UTR從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。第十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日珠蛋白基因globingene血紅蛋白含2個α和2個β鏈，分別由α鏈珠蛋白基因和β鏈珠蛋白基因的信息而形成。哺乳動物的α鏈基因和β鏈基因在結(jié)構(gòu)上相似，都是由2個內(nèi)含子而分為3個外顯子部分。α鏈基因和β鏈基因的內(nèi)含子1的長度約為120個堿基對，而對內(nèi)含子2，β鏈很長（例如人的α鏈基因之一的α2，內(nèi)含子2含140個堿基對，而β鏈基因含849個堿基對）。珠蛋白基因在哺乳類是數(shù)次重復(fù)的結(jié)構(gòu)，形成一種多重基因群。珠蛋白（英文名為“globin”）是具有攜帶氧能力的蛋白質(zhì)。在脊椎動物體內(nèi)有兩種類型：即存在于血液中血紅蛋白和肌肉中肌紅蛋白，目前在神經(jīng)系統(tǒng)又發(fā)現(xiàn)了第三種珠蛋白。第十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.8

MammaliangenesforDHFRhavethesamerelativeorganizationofrathershortexonsandverylongintrons,butvaryextensivelyinthelengthsofcorrespondingintrons.圖2.8

哺乳動物的DHFR基因具有相似的構(gòu)成，即它有較短的外顯子和較長的內(nèi)含子，但相應(yīng)的內(nèi)含子之間的長度變化廣泛。

DHFR：二氫葉酸還原酶

(dihydrofolatereductase)DHFR基因具有一個不變的結(jié)構(gòu)第二十頁，共八十七頁，2022年，8月28日Conservationofexonscanbeusedasthebasisforidentifyingcodingregionsbyidentifyingfragmentswhosesequencesarepresentinmultipleorganisms.外顯子的保守性可以做為鑒定編碼區(qū)的基礎(chǔ)，即通過確認(rèn)那些在許多生物體中都存在的序列片段。2.4Genescanbeisolatedbytheconservationofexons(通過外顯子的保守性可以分離基因)(2.6)KeyConcepts關(guān)鍵概念第二十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日Inaregioncontainingagenewhosefunctionhasbeenconservedamongarangeofspecies,thesequencerepresentingtheproteinshouldhavetwodistinctiveproperties:itmusthaveanopenreadingframe(openreadingframe,ORF);itislikelytohavearelatedsequenceinotherspecies.對于含有這樣基因的區(qū)域，即在許多生物中這些基因的功能長期被保留下來，這個序列所代表的蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)有兩個特性：它必須有一個開放閱讀框(ORF)；在其他生物中很可能存在與它相關(guān)的序列。第二十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日Southernblotting基本概念及原理

Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

第二十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日

Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進(jìn)行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得。

Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學(xué)的首創(chuàng)的，Southern印跡雜交故因此而得名。第二十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日Anothertechniquethatallowsgenomicfragmentstobescannedrapidlyforthepresenceofexonsiscalledexontrappingshowsthatitstartswithavectorthatcontainsastrongpromoter,andhasasingleintronbetweentwoexons.Whenthisvectoristransfectedintocells,itstranscriptiongenerateslargeamountsofanRNAcontainingthesequencesofthetwoexons.

另外一種技術(shù)即對基因組片段迅速掃描從而得知外顯子的存在叫外顯子捕獲技術(shù)。外顯子捕捉技術(shù)要求一個帶有強(qiáng)啟動子的載體且在兩個外顯子之間只有一個內(nèi)含子。當(dāng)這個載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的含有兩個外顯子序列的RNA。第二十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.12

Aspecialsplicingvectorisusedforexontrapping.Ifanexonispresentinthegenomicfragment,itssequencewillberecoveredinthecytoplasmicRNA,butifthegenomicfragmentconsistssolelyofsequencesfromwithinintron,splicingdoesnotoccur,andthemRNAisnotexportedtothecytoplasm.

3’

剪接點(diǎn)5’

剪接點(diǎn)

轉(zhuǎn)錄和剪接載體在轉(zhuǎn)錄物中含有兩個通過剪接連在一起的外顯子圖2.12

此技術(shù)用了一種特殊的載體。如果基因組片段中含有一個外顯子，那么它的序列可以在細(xì)胞質(zhì)RNA中被發(fā)現(xiàn)；但如果基因組片段中只由內(nèi)含子中的序列組成，那么剪接就不會發(fā)生，且mRNA也不會運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。一特殊載體用于外顯子捕捉基因組片段轉(zhuǎn)錄和剪接外顯子插基因組片段到內(nèi)含子中第二十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日2.5SomeDNAsequencescodeformorethanoneprotein

(一些DNA序列編碼一種以上蛋白質(zhì))(2.8)KeyConcepts?Theuseofalternativeinitiationorterminationcodonsallowstwoproteinstobegeneratedwhereoneisequivalenttoafragmentoftheother.?NonhomologousproteinsequencescanbeproducedfromthesamesequenceofDNAwhenitisreadindifferentreadingframesbytwo(overlapping)genes.?Homologousproteinsthatdifferbythepresenceorabsenceofcertainregionscanbegeneratedbydifferential(alternative)splicing,whencertainexonsareincludedorexcluded.Thismaytaketheformofincludingorexcludingindividualexonsorofchoosingbetweenalternativeexons.第二十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日第二十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日起始(或終止)的可選擇性可以產(chǎn)生相關(guān)的蛋白質(zhì)全長蛋白質(zhì)部分長度蛋白質(zhì)選擇性起始點(diǎn)Figure

2.17Twoproteinscanbegeneratedfromasinglegenebystarting(orterminating)expressionatdifferentpoints.圖2.17

通過在不同的起始位點(diǎn)起始表達(dá)或在不同的終止位點(diǎn)終止表達(dá),一條基因可以翻譯出兩種不同的蛋白質(zhì)。第二十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.18

TwogenesmaysharethesamesequencebyreadingtheDNAindifferentframes.

不同的閱讀框可以使用重疊的三聯(lián)體密碼子蛋白質(zhì)1的密碼子蛋白質(zhì)2的密碼子圖2.18通過使用不同的讀框,兩條基因可共享一段DNA序列。第三十頁，共八十七頁，2022年，8月28日可變剪接可以替代外顯子Figure

2.19

AlternativesplicinggeneratestheαandβvariantsoftroponinT(可變剪接產(chǎn)生肌鈣蛋白T的和兩種類型).

第三十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日可變剪接使用不同外顯子的組合只有內(nèi)含子被剪接除去長蛋白質(zhì)有三個外顯子內(nèi)含子+外顯子2被剪接除去短蛋白質(zhì)只有外顯子1+外顯子3Figure

2.20

Alternativesplicingusesthesamepre-mRNAtogeneratemRNAsthathavedifferentcombinationsofexons.

圖2.20

可變剪接使用相同的前體mRNA，產(chǎn)生的mRNA含有不同的外顯子組合。第三十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日(一組基因假定具有共同特征，可以鑒定出在進(jìn)化過程中這組基因分開之前的一些性質(zhì))(所有的珠蛋白都具有3個外顯子和2個內(nèi)含子這種共同的組織形式，這意味著它們由一個祖先基因進(jìn)化而來

)KeyConceptsAcommonfeatureinasetofgenesisassumedtoidentifyapropertythatprecededtheirseparationinevolution.Allglobingeneshaveacommonformoforganizationwith3exonsand2introns,suggestingthattheyaredescendedfromasingleancestralgene.2.6Themembersofagenefamilyhavea

commonorganization

(基因家族成員具有共同的組織結(jié)構(gòu))(2.11)第三十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.24

Theexonstructureofglobingenescorrespondswithproteinfunction,butleghemoglobinhasanextraintroninthecentraldomain.

圖2.24

珠蛋白基因的外顯子結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的功能相一致，但是豆血紅蛋白的中央結(jié)構(gòu)域中含有一個額外的內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)域是被分開的亞鐵血紅素結(jié)合域豆血紅蛋白有一個額外的內(nèi)含子珠蛋白豆血紅蛋白第三十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日

珠蛋白（英文名為“globin”）是具有攜帶氧能力的蛋白質(zhì)。在脊椎動物體內(nèi)有兩種類型：即存在于血液中的血紅蛋白和肌肉中的肌紅蛋白，目前在神經(jīng)系統(tǒng)又發(fā)現(xiàn)了第三種珠蛋白。

豆科植物根瘤中的血紅蛋白，亦稱為根瘤血紅蛋白。這是1939年久保秀雄發(fā)現(xiàn)的。豆血紅蛋白關(guān)系著根瘤菌固氮的有效性。豆血紅蛋白存在類菌體的周圍，有截留和釋放氧分子的功能，既為類菌體的呼吸作用源源提供分子氧的快速細(xì)流，又保護(hù)了類菌體內(nèi)固氮酶免與氧直接接觸而受破壞。豆血紅蛋白存在于植物細(xì)胞的液泡中，對氧具有很強(qiáng)的親和力，因此對創(chuàng)造固氮作用所必須的厭氧條件是有利的。第三十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

2.25

Theratinsulingenewithoneintronevolvedbylosinganintronfromanancestorwithtwointerruptions.圖2.25

大鼠胰島素祖先基因含有兩個內(nèi)含子，進(jìn)化過程中丟失了一個，從而其基因結(jié)構(gòu)是由一個內(nèi)含子間隔兩個片段。普通胰島素基因(雞&大鼠)大鼠的第二條胰島素基因引導(dǎo)大鼠胰島素基因丟失了一個外顯子丟失內(nèi)含子引導(dǎo)編碼內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子編碼編碼外顯子第三十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日在肌動蛋白的基因進(jìn)化中，內(nèi)含子發(fā)生了很多變化Actingenesvarywidelyintheirorganization.Thesitesofintronsareindicatedinpurple

(肌動蛋白基因的構(gòu)成變化很大，內(nèi)含子的位置在圖中以紫色標(biāo)示)

Figure

2.26

(19個不同的位置,<7)第三十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日裂殖酵母

Schizomycetepombe釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，又稱麫包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因為傳統(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母是發(fā)酵中最常用的生物種類。釀酒酵母的細(xì)胞為球形或者卵形，直徑5–10μm。其繁殖的方法為出芽生殖。S.PombeS.cerevisiae(釀酒酵母)第三十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日

釀酒酵母是第一個完成基因組測序的真核生物，測序工作于1996年完成。釀酒酵母的基因組包含大約1200萬堿基對，分成16組染色體，共有6275個基因，其中可能約有5800個真正具有功能。據(jù)估計其基因約有23%與人類同源。酵母基因組數(shù)據(jù)庫包含有酵母基因組的詳細(xì)注釋(annotation)，是研究真核細(xì)胞遺傳學(xué)和生理學(xué)的重要工具。另一個重要的釀酒酵母數(shù)據(jù)庫由慕尼黑蛋白質(zhì)序列信息中心維護(hù)。釀酒酵母基因組第三十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日

因為釀酒酵母與同為真核生物的動物和植物細(xì)胞具有很多相同的結(jié)構(gòu)，又容易培養(yǎng)，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人們了解最多的生物之一。在人體中重要的蛋白質(zhì)很多都是在酵母中先被發(fā)現(xiàn)其同源物的，其中包括有關(guān)細(xì)胞周期的蛋白、信號蛋白和蛋白質(zhì)加工酶。釀酒酵母也是制作培養(yǎng)基中常用成分酵母提取物的主要原料。在科學(xué)中的作用第四十頁，共八十七頁，2022年，8月28日

棘阿米巴(acanthamoeba)是一類自由生活的小型原蟲，廣泛分布于自然界。棘阿米巴原蟲可引起人原發(fā)性腦炎和角膜炎。自1974年Nagington等首次報道棘阿米巴角膜炎以來全世界已相繼有數(shù)百例報道。棘阿米巴角膜炎是嚴(yán)重的致盲性眼病，其主要臨床特點(diǎn)為眼部劇烈疼痛和環(huán)形角膜基質(zhì)炎、角膜放射狀神經(jīng)炎。角膜輕度受損和局部抵抗力降低如皮質(zhì)類固醇激素的不適當(dāng)使用使棘阿米巴病原體易于侵入角膜而致病。Acanthamoeba(棘阿米巴)

美國Jones(1975)首次報道本病，近年發(fā)現(xiàn)多發(fā)于配戴接觸眼鏡的患者。如不能早期確診并有效治療，終可導(dǎo)致失明。棘阿米巴性角膜炎早期與病毒性角膜炎上皮型難以鑒別，多表現(xiàn)為單個或多個點(diǎn)或斑狀上皮不整或缺損，此后上皮下實質(zhì)表層出現(xiàn)斑狀或線條樣浸潤。本病早期癥狀不重，有輕度刺激或異物感。第四十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，C.elegans）

是一種可以獨(dú)立生存的線蟲（roundworm），長度約1mm，生活在溫度恒定的環(huán)境。自1965年起，科學(xué)家SydneyBrenner利用線蟲作為分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域的模式生物（animalmodel）。第四十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日

C.elegans有五對常染色體(autosome)和一對性染色體(sexchromsome)。是一個染色體數(shù)很少的二倍體。

細(xì)胞學(xué)特征

C.elegans做為一種典范生物(modelorganism)被大量應(yīng)用于現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)，遺傳學(xué)，基因組學(xué)的研究中。C.elegans在研究細(xì)胞分化(cellulardifferentiation)方面特別有貢獻(xiàn)，而且是第一個基因組(genome)完全被定序(sequencing)的多細(xì)胞生物。其基因組很小，僅有8×107bp，為人類基因組的3%，約有13,500個基因。且C.elegans與原核相似，有25%左右的基因產(chǎn)生多順反子mRNA（PolycistronicmRNA），此和它們通過反式剪接使下游基因的到表達(dá)有關(guān)。C.elegans大部分是XX型的雌雄同體個體（hermaphrodites）大約每500個蠕蟲有1個是XO型的雄體，此是染色體不分離的結(jié)果。第四十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日

C.elegans的優(yōu)勢在于為一種多細(xì)胞(multicellular)真核生物(eukaryote)。雌雄同體成蟲有959個體細(xì)胞；雄成蟲有1031個。且每一個體細(xì)胞(somaticcell)()的發(fā)育情況都研究得較為清楚。這個細(xì)胞世系(celllineage)的規(guī)律在各個個體之間是幾乎不變的。兩種性別的個體，都有許多多出的細(xì)胞(雌雄同體131個，大部分原本會成為神經(jīng)元)將經(jīng)由細(xì)胞凋亡(apoptosis)的過程被除去。在2002年，諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(NobelPrize)頒發(fā)給SydneyBrenner、H.RobertHorvitz和JohnSulston以表彰他們通過對C.elegans

的研究揭示細(xì)胞的程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)機(jī)制，及器官發(fā)育遺傳學(xué)的貢獻(xiàn)。第四十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日D.melanogaster(Drosophilamelanogaster

)

果蠅屬雙翅目果蠅科。果蠅種類很多，僅果蠅屬（Drosophila）就超過1000種，該屬中有許多種類危害食用菌。還有一個菌果蠅屬（Mycodrosophila）則幾乎全部種類都生活在真菌上。國內(nèi)外已確定危害食用菌果蠅主要種類有食菌大果蠅（Drosophilaimmigrans）、布氏果蠅（D.busckii）、黑木耳果蠅（Drosophilasp.）和黑腹果蠅（D.melanogaster），現(xiàn)以黑腹果蠅為例作介紹。第四十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日

（1）形態(tài)特征成蟲：體長4毫米左右，黃褐色，腹末5～7節(jié)有黑色環(huán)紋；復(fù)眼有紅白兩種變型；觸角第三節(jié)圓形；翅透明，前緣脈上有2個缺口，腹部粗短。卵：乳白色，長約0.5毫米，卵表有網(wǎng)狀小格，前端有2根卵絲。幼蟲：蛆形，乳白色，體長4.5～5.5毫米。蛹：圍蛹，初期白色，后漸變黃褐色。（2）發(fā)生規(guī)律黑腹果蠅每天繁殖多代，溫度在10℃時卵期長達(dá)57天，15℃時為18天，20～25℃時為6～4天。世代歷期在20～25℃時為12～15天。成蟲喜產(chǎn)卵于爛果及發(fā)酵物上，危害毛木耳、黑木耳時產(chǎn)卵于耳片上，孵化后幼蟲鉆入耳肉內(nèi)取食營養(yǎng)，導(dǎo)致爛耳，使子實體萎縮，并使菌塊易感染雜菌，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。第四十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日ReviewofChapter2Alltypesofeukaryoticgenomescontaininterruptedgenes.Intronsarefoundinallclassesofeukaryoticgenes.Thesizeofageneisdeterminedprimarilybythelengthsofitsintrons.

所有類型的真核生物基因組都含有斷裂基因。真核生物中所有類型的基因都存在內(nèi)含子?；虻拇笮≈饕伤膬?nèi)含子長度決定。第四十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日CH3

THECONTENT

OFTHEGENOME

基因組概述第四十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日3.1Introduction

3.2Genomescanbemappedbylinkage,restrictioncleavage,orDNAsequence(用連鎖、限制酶切割或者DNA測序繪制基因組圖譜

)3.3Individualgenomesshowextensivevariation(個體基因組變化很大

)3.4RFLPsandSNPscanbeusedforgeneticmapping(RFLP和SNP能夠用來繪制遺傳圖譜

)3.5Whyaregenomessolarge(基因組為何如此之大

)?3.6ThehumangenomehasfewergenesthanExpected(人類基因組的基因數(shù)目比預(yù)想的要少

)第四十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日3.7Howmanygenesareessential(有多少基因是必需的

)?3.8Genesareexpressedatwidelydifferinglevels(基因的表達(dá)量相差很大

)3.9OrganelleshaveDNA(細(xì)胞器也含有DNA)3.10OrganellegenomesarecircularDNAsthatcodefororganelleproteins(細(xì)胞器基因組是環(huán)狀ONA分子，它們編碼細(xì)胞器蛋白質(zhì))3.11MitochondrialDNAorganizationisvariable(線粒體DNA的結(jié)構(gòu)是可變的

)3.12Mitochondriaevolvedbyendosymbiosis(線粒體是通過內(nèi)共生演化來的

)3.13ThechloroplastgenomecodesformanyproteinsandRIMAs(葉綠體基因組編碼多種蛋白質(zhì)和RNA)第五十頁，共八十七頁，2022年，8月28日

3.1IntroductionThegenomeisthecompletesetofgenesofanorganism.UltimatelyitisdefinedbythecompleteDNAsequence,althoughasapracticalmatteritmaynotbepossibletoidentifyeverygeneunequivocallysolelyonthebasisofsequence.基因組（genome）是有機(jī)體內(nèi)一組完整的基因，它最終由DNA的全序列決定，實際上我們不可能只根據(jù)序列來準(zhǔn)確鑒定每一條基因。下次(2013年這個地方要看2011年的L5、按L5講)

第五十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日Thetranscriptomeisthecompletesetofgenesexpressedunderparticularconditions.ItisdefinedintermsofthesetofRNAmoleculesthatispresent,andcanrefertoasinglecelltypeortoanymorecomplexassemblyofcellsuptothecompleteorganism.BecausesomegenesgeneratemultiplemRNAs,thetranscriptomeislikelytobelargerthanthenumberofgenesdefineddirectlyinthegenome.ThetranscriptomeincludesnoncodingRNAsaswellasmRNAs.

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是在特定條件下表達(dá)的一組完整基因，這是根據(jù)細(xì)胞中所存在的某一組RNA分子來決定，它可以指一種細(xì)胞類型，或者是任何一個更為復(fù)雜的細(xì)胞群體，甚至是一個完整的有機(jī)體。由于一條基因可能產(chǎn)生多條mRNA分子，所以從轉(zhuǎn)錄組定義的基因數(shù)目可能大于基因組中定義的基因數(shù)目。轉(zhuǎn)錄組包括非編碼的RNA和編碼的mRNA

。第五十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日Theproteome

isthecompletesetofproteins.ItshouldcorrespondtothemRNAsinthetranscriptome,althoughtherecanbedifferencesofdetailreflectingchangesintherelativeabundanceorstabilitiesofmRNAsandproteins.Itcanbeusedtorefertothesetofproteinscodedbythewholegenomeorproducedinanyparticularcellortissue.

蛋白質(zhì)組（proteome）是一組完整的蛋白質(zhì)，它應(yīng)該對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄組中的mRNA

。雖然在相對豐度或者穩(wěn)定性上，mRNA和蛋白質(zhì)有一些細(xì)微的差別，但它可以用來指由整個基因組編碼的一組蛋白質(zhì)，或者在某些特殊的細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)。第五十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日3.2Genomescanbemappedbylinkage,restrictioncleavage,orDNAsequence(用連鎖、限制酶切割或者DNA測序繪制基因組圖譜

)第五十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日Agenetic(orlinkage)map

identifiesthedistancebetweenmutationsintermsofrecombinationfrequencies.Itislimitedbyitsrelianceontheoccurrenceofmutationsthataffectthephenotype.Becauserecombinationfrequenciescanbedistortedrelativetothephysicaldistancebetweensites,itdoesnotaccuratelyrepresentphysicaldistancesalongthegeneticmaterial.

遺傳圖譜（geneticmap）或連鎖圖譜（linkagemap）是根據(jù)重組頻率來確定突變位點(diǎn)之間的距離。這種方法需要依靠對表型有影響的突變體的產(chǎn)生，故其應(yīng)用非常有限，而且由于重組頻率并不能準(zhǔn)確反映位點(diǎn)之間的物理距離，所以它不能確切反映遺傳物質(zhì)的物理距離。第五十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日Arestrictionmap

isconstructedbycleavingDNAintofragmentswithrestrictionenzymesandmeasuringthedistancesbetweenthesitesofcleavage.ThisrepresentsdistancesintermsofthelengthofDNA,soitprovidesaphysicalmapofthegeneticmaterial.

限制圖譜（restrictionmap）是通過用限制性內(nèi)切核酸酶把DNA切成片段，然后測量切割位點(diǎn)之間的距離來構(gòu)建的。這是用DNA的長度來表示距離的，因此，它提供了遺傳物質(zhì)的物理圖譜（physicalmap

）。第五十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日Bycomparingthesequenceofawild-typeDNAwiththatofamutantallele,wecandeterminethenatureofamutationanditsexactsiteofoccurrence.Thisdefinestherelationshipbetweenthegeneticmap(basedentirelyonsitesofmutation)andthephysicalmap(basedonorevencomprisingthesequenceofDNA).(通過比較野生型和突變型等位基因的DNA序列，我們能夠確定突變的本質(zhì)以及突變發(fā)生的準(zhǔn)確位置。通過這種方式，我們可以確定遺傳圖譜（完全根據(jù)突變位置）和物理圖（根據(jù)比較DNA序列）的關(guān)系。)第五十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日Similartechniquesareusedtoidentifyandsequencegenesandtomapthegenome.Ineachcase,theprincipleistoobtainaseriesofoverlappingfragmentsofDNA,whichcanbeconnectedintoacontinuousmap.Thecrucialfeatureisthateachsegmentisrelatedtothenextsegmentonthemapbycharacterizingtheoverlapbetweenthem,sothatwecanbesurenosegmentsaremissing.

(這些相似的技術(shù)可被用來鑒定和測序基因以及繪制基因組圖譜。原則上，我們都要獲得一系列的DNA重疊片段，然后將這些重疊片段互相連接，形成連續(xù)圖譜。關(guān)鍵是通過分析它們之間的重疊部分，在圖譜上，將每一片段與另一片段聯(lián)系起來，這樣我們就能夠確保不丟失某些片段。)第五十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日3.3Individualgenomesshowextensivevariation

(個體基因組變化很大)

第五十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日TheoriginalMendelianviewofthegenomeclassifiedallelesaseitherwild-typeormutant.Subsequentlywerecognizedtheexistenceofmultiplealleles,eachwithadifferenteffectonthephenotype.Insomecasesitmaynotevenbeappropriatetodefineanyonealleleas“wild-type”.(最初的孟德爾觀點(diǎn)認(rèn)為基因組的等位基因不是野生型就是突變型。后來我們認(rèn)識到機(jī)體存在著多條等位基因，每一條等位基因都會對表型產(chǎn)生不同的影響，所以在一些例子中，定義某一種等位基因為野生型是不恰當(dāng)?shù)摹?第六十頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure1.29Thewlocushasanextensiveseriesofalleles,whosephenotypesextendfromwild-type(red)colortocompletelackofpigment.(w基因座上有一系列的等位基因，其表型從野生型(紅眼)到無色)。紅眼(野生表型)血紅桃紅淺黃蜜黃杏黃曙黃象牙白檸檬黃雜色白色(無色)每個等位基因具有不同的表型等位基因純合子表型(w+相對其他基因來說是顯性的，它們有很多不同的突變等位基因)第六十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日

Thecoexistenceofmultipleallelesatalocusiscalledgeneticpolymorphism.Anysiteatwhichmultipleallelesexistasstablecomponentsofthepopulationisbydefinitionpolymorphic.Analleleisusuallydefinedaspolymorphicifitispresentatafrequencyof>1%inthepopulation.

(我們把在一個基因座上有多條等位基因的現(xiàn)象稱作遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）。當(dāng)多條等位基因在一個種群中穩(wěn)定存在時，這些等位基因所在的位置被認(rèn)為是多態(tài)性的。如果某條等位基因在種群中存在的概率大于1%，那么我們就可以認(rèn)為它是多態(tài)性的。)第六十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日

Achangeinasinglenucleotidewhenallelesarecomparediscalledasinglenucleotidepolymorphism(SNP).Oneoccursevery~1330basesinthehumangenome.DefinedbytheirSNPs,everyhumanbeingisunique.

(當(dāng)比較等位基因時，其單個核苷酸的改變被稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。在人類基因組中，大約每1330個堿基就有一個單核苷酸多態(tài)性。從SNP的角度來看，每一個人的基因組都是獨(dú)一無二的，SNP可以通過不同的方法進(jìn)行檢測，從直接的序列比較到質(zhì)譜或者生物化學(xué)方法，這些方法都是根據(jù)在特定區(qū)域中序列的變化來顯示差異的。)第六十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日Figure

3.1

Apointmutationthataffectsarestrictionsiteisdetectedbyadifferenceinrest