分子生物學(xué)的生物合成轉(zhuǎn)錄

分子生物學(xué)的生物合成轉(zhuǎn)錄1第一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄RNADNA此過程把DNA的堿基序列轉(zhuǎn)抄成RNA。5′3′3′5′編碼鏈3′5′模板鏈2第二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別3第三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:NTP模板:DNA酶:RNA聚合酶RNApolymerase,RNA-pol其他蛋白質(zhì)因子bAOCH2POPP~~ATPOCH2POPP~~UUTPGOCH2POPP~~GTPCOCH2POPP~~CTP4第四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)模板和酶TemplatesandEnzymes5第五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日一、轉(zhuǎn)錄模板DNA分子上能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)。DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作信息鏈、轉(zhuǎn)錄鏈、有意義鏈或Watson鏈。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(codingstrand)，也稱為非轉(zhuǎn)錄鏈、反義鏈或Crick鏈。6第六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

(asymmetrictranscription)轉(zhuǎn)錄對(duì)DNA鏈的選擇性稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。有兩方面的含義：在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。7第七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日二、RNA聚合酶（一）原核生物的RNA聚合酶目前研究比較透徹的是E.coli的RNA聚合酶。其它原核生物的RNA聚合酶在結(jié)構(gòu)、組成、功能上都與E.coli的RNA聚合酶相似。所有原核生物RNA聚合酶都受利福平或利福霉素抑制。8第八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日真核生物的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)鵝膏蕈堿反應(yīng)耐受極敏感中度敏感ⅢⅡⅠ45SrRNAHnRNA5S-rRNAtRNAsnRNARNA聚合酶9第九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（二）真核生物的RNA聚合酶已發(fā)現(xiàn)三種RNA聚合酶分別稱為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，專一性地轉(zhuǎn)錄不同的基因，生成不同的產(chǎn)物i。鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶的特異性抑制劑，但敏感性不同。10第十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日三、模板上酶的辨認(rèn)、結(jié)合原核生物一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列操縱子：轉(zhuǎn)錄單位或轉(zhuǎn)錄區(qū)段啟動(dòng)子RNA-PolRNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，稱為啟動(dòng)子(promoter)。11第十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日對(duì)啟動(dòng)子的研究方法

RNA-Pol保護(hù)法1）分離某段基因并與純RNA-pol混合；2）加入核酸外切酶（胰DNA酶）水解DNA；3）分離被RNA聚合酶結(jié)合而未被水解的基因片段；4）測(cè)定并分析保護(hù)區(qū)（40-60bp）的堿基序列；12第十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日RNA-pol的移動(dòng)TTGACAAACTGTTATAATATATTARNA-pol-40-35-30-25-20-15-10-50+5+10+15+20+25啟動(dòng)子保守序列開始轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)13第十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日真核生物啟動(dòng)子保守序列順式作用元件-GCGC---CAAT---TATA結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始TATA盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子14第十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)轉(zhuǎn)錄過程TheProcessofTranscription15第十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日一、原核生物的轉(zhuǎn)錄過程（一）轉(zhuǎn)錄起始就是RNA-Pol結(jié)合到DNA模板上的起始區(qū)域，DNA雙鏈局部解開，一條鏈作模板面加入第一個(gè)、第二個(gè)NTP，RNA-Pol催化形成第一個(gè)磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成。RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH316第十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi17第十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日1、轉(zhuǎn)錄空泡RNA-Pol（核心酶）-DNA-RNA形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物RNA聚合酶可以覆蓋40bp以上長(zhǎng)度的DNA轉(zhuǎn)錄解鏈范圍小于20bp雜化雙鏈長(zhǎng)度約12bpNMP逐個(gè)加入遇到模板為A時(shí)加入的是U不是TRNA-Pol向下游移動(dòng)時(shí)RNA分子的5′pppG······的結(jié)構(gòu)仍然保留18第十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日35￠DNARNA聚合酶核糖體RNA2、原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象19第十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（三）轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。分類1、依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止2、非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止20第二十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日2.非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)。舉例：大腸桿菌核蛋白體蛋白基因大腸桿菌色氨酸操縱子21第二十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日二、真核生物的轉(zhuǎn)錄起始（一）轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化。轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。22第二十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日3.轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物

(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。23第二十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日4.模板理論(piecingtheory)拼板理論認(rèn)為：一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性，有專一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。24第二十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)RNA-pol前移處處都遇上核小體，二者大小差別不大。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中可以觀察到核小體移位（僅見于試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄）和解聚現(xiàn)象。真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。25第二十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（三）真核生物的轉(zhuǎn)錄終止真核生物轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。1．真核生物DNA上有轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。已知真核生物DNA讀碼框架的3′端均含富含AT的序列（如AATAAA或ATTAAA等）；相隔0-30bp后又出現(xiàn)TTTT順序（通常是3-5個(gè)T）；該結(jié)構(gòu)可能與轉(zhuǎn)錄終止及3′端加polyA有關(guān)。2．轉(zhuǎn)錄越過轉(zhuǎn)錄修飾點(diǎn)后的RNA在修飾點(diǎn)被切斷，隨即“加尾”、“戴帽”。余下RNA繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但產(chǎn)物很快被酶水解。26第二十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾3′processing5′mGpppG－－－AAUAAA－Poly（A）Nuclease3′－－AATAAA－－GTGTGTG5′－－PAUSE－－3′－－5′3′－－5′－－－－3′－－5′Release5′－－AAUAAA－－GUGUGUGRNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn)RNA-polⅡ27第二十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾Post-transcriptionalModification28第二十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)29第二十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日一、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）首、尾的修飾5端形成帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)30第三十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日PolyA的形成mRNA5′m7GpppGAAUAAA3′H2O核苷酸片段核酸內(nèi)切酶nATPnPPiPoly(A)聚合酶mRNA5′m7GpppGAAUAAAOH3′mRNA5′m7GpppGAAUAAAAAA(A)nOH3′31第三十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（二）mRNA的剪接1.hnRNA和snRNA核內(nèi)的初級(jí)mRNA稱為雜化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)mRNA來自hnRNA（去掉中間片段）snRNA(smallnuclearRNA)核內(nèi)的蛋白質(zhì)小分子核糖核酸蛋白體（并接體,splicesome）snRNA32第三十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日mRNA來自hnRNA核酸序列分析證明：mRNA是去掉大部分中間片段的hnRNA。核酸雜交實(shí)驗(yàn)證明：hnRNA與DNA模板鏈可以完全配對(duì)；而mRNA與DNA模板鏈雜交則出現(xiàn)部分配對(duì)的局部雙鏈區(qū)域和中間相當(dāng)多的鼓泡狀突出的單鏈區(qū)段。因此提出真核生物基因的斷裂性的概念。33第三十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日核酸雜交實(shí)驗(yàn)3′5′模板DNAhnRNA3′5′全長(zhǎng)互補(bǔ)3′5′模板DNA成熟mRNA3′5′局部互補(bǔ)鼓泡狀突出34第三十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日核酸雜交實(shí)驗(yàn)雞卵清蛋白成熟mRNA（虛線部分）與基因DNA（實(shí)線部分）分子雜交后電鏡所見。7個(gè)內(nèi)含子（鼓泡狀突出部分）將8個(gè)外顯子分開。成熟mRNA模板DNA35第三十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日斷裂基因(splitegene)真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。編碼區(qū)A、B、C、DABCD非編碼區(qū)36第三十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日2.外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)外顯子在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。37第三十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日胰島素基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物胰島素基因（編碼鏈）5′3′intronintronSBCCAPre成熟mRNASBCAPre轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)物前胰島素原翻譯產(chǎn)物翻譯后加工修飾產(chǎn)物信號(hào)肽前導(dǎo)序列B亞基C肽A亞基SBCAPre胰島素SSSSBA38第三十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日斷裂基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾

注：涂黑處為前導(dǎo)順序（L）和外顯子（1、2、3、4、5、6、7）7.7kb卵清蛋白基因hnRNAGpppGAAA···AAA首尾修飾的hnRNAGpppGAAA···AAA剪接中的套索RNAL1276543GpppGAAA···AAA胞漿mRNA39第三十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日3.內(nèi)含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內(nèi)含子分為4類。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA；III：是常見的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內(nèi)含子；IV：是tRNA基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的內(nèi)含子，剪接過程需酶及ATP。40第四十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日4.mRNA的剪接除去hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接為成熟的RNA的過程稱為剪接。剪接的模式：內(nèi)含子區(qū)段彎曲，使相鄰的兩個(gè)外顯子互相靠近而利于剪接，稱為套索RNA（lariatRNA）內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：大多數(shù)內(nèi)含子都以5′-GU…開始，而其末端則為…AG-OH-3′。5′-GU……AG-OH-3′稱為剪接接口（splicingjunction）或邊界序列。剪接后，GU或AG不一定被剪除。41第四十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日snRNA（smallnuclearRNA）核內(nèi)小RNA由百余個(gè)至300個(gè)核苷酸組成，分子中以U含量最豐富，故以U作分類命名?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有snRNAU1、U2、U3、U4、U5、U6等類別。小分子核糖核蛋白體（smallnuclearribonucleoprotein，snRNP）：由snRNA和核內(nèi)蛋白質(zhì)組成，作為RNA剪接的場(chǎng)所。剪接體或并接體（splicesome）：由snRNP與hnRNA結(jié)合形成套索并拉近上、下游外顯子距離的復(fù)合體。剪接體本身有剪接酶活性。剪接體可以結(jié)合在hnRNA內(nèi)含子區(qū)段并使內(nèi)含子彎曲、兩斷接近，利于剪接。42第四十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日剪接過程（A.Klessig模式）（1）首先snRNP與hnRNA結(jié)合：snRNP上的U1-snRNA和U2-snRNA分別靠堿基互補(bǔ)關(guān)系去辨認(rèn)、結(jié)合hnRNA上內(nèi)含子的5′-GU和AG-OH-3′末端。U4、U5、U6加入形成完整的剪接體。2個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子因?yàn)榕c剪接體的結(jié)合而彎曲，使兩個(gè)末端互相靠近形成套索，上下游的外顯子互相靠近，有利于進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。內(nèi)含子靠近3′端有一個(gè)甲基化的嘌呤核苷酸：如3mG，是形成套索的關(guān)鍵所在。43第四十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日U1-snRNAUC-CAUACAUApppmGU1-snRNPU2-snRNAAUGAUGUpppmGU2-snRNPsnRNP與hnRNA的結(jié)合內(nèi)含子可以彎成套索UACUACA-AGAG-GUAUGU外顯子1外顯子2hnRNA5′3′44第四十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U545第四十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日（2）mRNA的剪接過程除掉內(nèi)含子、連接外顯子：兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)（transesterification）UpAGpUU-OH（pppG、ppG）pG-OH（輔酶）pAGpUUpUpAG-OH轉(zhuǎn)酯反應(yīng)1（親電子攻擊）轉(zhuǎn)酯反應(yīng)2pGpG外顯子1外顯子2內(nèi)含子46第四十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日肝臟apoB100（分子量為500000）5.mRNA的編輯(mRNAediting)?RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。人類apoB基因mRNA（14500個(gè)核苷酸）mRNA編輯腸道細(xì)胞apoB48（分子量為240000）47第四十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日二、tRNA前體的后加工（一）tRNA前體的后加工的內(nèi)容1．切除多余的順序（1）含單個(gè)tRNA的tRNA前體：在5′端和3′端各有一段多余順序；（2）含二個(gè)tRNA的tRNA前體：5′端和3′端有長(zhǎng)短不一的多余順序，在兩個(gè)tRNA之間還有數(shù)目不等的核苷酸隔開。（3）有的真核tRNA前體的反密碼子環(huán)區(qū)含有一個(gè)居間順序。48第四十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日RNA-polⅢ轉(zhuǎn)錄的基因及其初級(jí)產(chǎn)物TloopDHU-loopCAC虛線部分要在轉(zhuǎn)錄后加工剪除同時(shí)在3′末端加上“—CCA”TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCC49第四十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNATGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNAtRNA前體RNApolⅢRNApolⅢtRNA前體50第五十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日tRNA的剪接是酶促反應(yīng)切除以下實(shí)驗(yàn)可以推論和證實(shí)tRNA的剪接是需要酶的：成熟的tRNA能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制tRNA的剪接，這是酶促反應(yīng)的特征之一。tRNA的成熟過程對(duì)溫度敏感。內(nèi)含子的核酸內(nèi)切酶由tRNA基因內(nèi)含子編碼反應(yīng)需要ATP供能RNaseP及內(nèi)切酶tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶及連接酶ATPA-OHCC51第五十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日2．各種稀有堿基的生成（1）甲基化：如tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)：嘌呤→甲基嘌呤。（2）還原反應(yīng)：U→DHU。（3）核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應(yīng)：尿嘧啶核苷→假尿嘧啶核苷（ψ：psai）。（4）脫氨基反應(yīng)：A→I。3．在3′-末端出去個(gè)別