第七章酶非水相催化

第七章酶的非水相催化授課教師：孫恒一

EnzymaticcatalysisinNon-aqueousphase酶催化反應的介質(zhì)水是酶促反應最常用的反應介質(zhì)。但對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物(底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。由于水的存在，往往有利于水解、消旋化、聚合和分解等副反應的發(fā)生。1984年，克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機介質(zhì)中進行了酶催化反應的研究，他們成功地在利用酶有機介質(zhì)中的催化作用，獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物，明確指出酶可以在水與有機溶劑的互溶體系或雙液相體系中進行催化反應。是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化？？酶非水相催化概念：酶在非水介質(zhì)中的催化作用。通過反應介質(zhì)的改變，使酶的表面結構和活性中心發(fā)生某些改變，從而改進酶的催化特性。Contentsofchapter71、酶催化的主要內(nèi)容和特點2、有機介質(zhì)對酶催化反應的影響

3、酶在有機介質(zhì)中的催化特性

4、有機介質(zhì)中酶催化反應的影響因素GoGoGoGo5、酶非水相催化的應用

Go本章目錄第一節(jié)

酶非水相催化的主要內(nèi)容和特點一、酶非水相催化的主要內(nèi)容二、酶非水相催化的特點一酶非水相催化的主要類型有機介質(zhì)中的酶催化氣相介質(zhì)中的酶催化超臨界流體介質(zhì)中的酶催化離子液介質(zhì)中的酶催化1.有機介質(zhì)中的酶催化概念：指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。特點：適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。原因：酶在有機介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結構和活性中心的空間構象。2.氣相介質(zhì)中的酶催化概念：酶在氣相介質(zhì)中進行的催化反應。特點：適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應。原因：由于氣體介質(zhì)的密度低，擴散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。3.超臨界流體介質(zhì)中的酶催化概念：酶在超臨界流體中進行的催化反應。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點的流體。對酶的結構和催化作用無明顯作用或不良影響；化學穩(wěn)定性良好，對設備無腐蝕性；溫度最好在室溫或酶最適溫度附近；壓力不能太高，節(jié)約費用；容易獲得，價格低廉等。4.離子液介質(zhì)中的酶催化概念：酶在離子液中進行的催化作用。離子液（ionicliquids）是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點。二酶非水相催化的特點酶的熱穩(wěn)定性提高；酶的催化活性有所降低；水解酶催化水解反應的逆反應；非極性底物或產(chǎn)物的溶解度增加；底物特異性和選擇性有所改變。酶在非水介質(zhì)中催化與水相中催化相比：1.提高熱穩(wěn)定性原因：在無水狀態(tài)下，酶分子空間構象更穩(wěn)定；在非水介質(zhì)中，缺少引起酶分子變性失活的水分子。例如脫氨基作用、肽鍵水解、氧化作用、二硫鍵的破壞等。胰脂肪酶：在水溶液中100°C時較快失活；在有機介質(zhì)中100°C時半衰期長達數(shù)小時。有機介質(zhì)相比水溶液中酶的熱穩(wěn)定性更好。2.降低催化活性原因：酶的空間結構受到破壞，使催化活性受到影響。堿性磷酸酶：凍干粉懸浮于乙腈中20h，60%以上不可逆失活；若懸浮于丙酮中36h，75%以上不可逆失活。有機溶劑的極性越強，越容易奪取酶分子結合水，對酶催化活性影響越大。3.催化水解反應的逆反應在水溶液中，水解酶只催化進行水解反應，無法催化逆反應；在非水介質(zhì)中，水解酶可催化水解反應的逆反應。脂肪酶催化酯類合成、蛋白酶催化多肽合成4.增加溶解度非極性物質(zhì)在水中溶解度較低，在有機介質(zhì)中溶解度較高；通過提高非極性底物或產(chǎn)物的溶解度，從而提高反應速度。5.改變底物特異性和選擇性酶分子活性中心的結合部位與底物之間的結合狀態(tài)發(fā)生某些變化，致使酶的底物特異性和選擇性會發(fā)生改變。第二節(jié)

有機介質(zhì)中水和有機溶劑對酶催化反應的影響有機介質(zhì)反應體系水對有機介質(zhì)中酶催化的影響有機溶劑對有機介質(zhì)中酶催化的影響（一）有機介質(zhì)反應體系不管采用何種有機介質(zhì)反應體系，酶催化反應的介質(zhì)中都含有機溶劑和一定量的水。它們都對催化反應有顯著的影響。反應體系對酶酯化反應的影響1：水飽和正已烷10ml，2∶pH7.2緩沖液5ml+正已烷10ml反應體系含1-三甲基硅-1-乙醇10mM，戊酸10mM，內(nèi)標正十五烷，脂肪酶50mg，30℃，120rpm條件下振蕩反應1.微水介質(zhì)體系(microaqueousmedia)概念：非極性有機溶劑和微量的水組成的反應體系，使凍干粉或固體酶懸浮在有機相中。體系中含有必需的結合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的狀態(tài)可以是結晶態(tài)、凍干狀態(tài)、沉淀狀態(tài)，或者吸附在固體載體表面上。2.與水互溶的有機溶劑水單相體系由極性較大的有機溶劑與水相互混溶形成均勻的單相溶液反應體系。酶、底物和產(chǎn)物都能溶解于這種均一體系中。辣根過氧化物酶（HRP）在此均一體系中催化酚類或芳香胺類底物發(fā)生聚合反應3.非極性有機溶劑水兩相/多相體系由疏水性較強的有機溶劑(高脂溶性)和水所組成的兩相或多相體系。酶、親水性底物或產(chǎn)物溶解于水相；疏水性底物或產(chǎn)物溶解于有機溶劑相。催化反應通常在兩相界面進行。4.正反膠束體系正膠束反膠束水溶液多少與水不相容有機溶劑少多表面活性劑++微小液滴水包油油包水極性端朝外朝內(nèi)非極性端朝內(nèi)朝外（二）水對酶催化反應的影響酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進行催化反應。所以水是不可缺少的成分之一。有機介質(zhì)中的水含量多少對酶的空間構象、催化活性、穩(wěn)定性、催化反應速度等都有密切關系。水還與酶催化作用的底物和反應產(chǎn)物的溶解度有關。1.水對酶分子空間構象的影響酶分子只有在空間構象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構象被破壞，酶將變性失活。故酶分子需要一層水化層以維持其完整的空間構象。必需水（essentialwater）是指維持酶分子完整的空間構象所必需的最低水量。維持氫鍵、鹽鍵等副鍵所必需的。2.水對酶催化反應速度的影響有機介質(zhì)中水含量對酶催化反應速度有顯著影響。水含量較低情況下，催化反應速度隨水含量增加而先升高后降低，達到一定量時，催化反應速度達到最大，稱為最適水含量。最適水含量隨有機溶劑種類、固定化載體特性、修飾劑種類等變化而有所差別。3.水活度酶的催化活性隨結合水含量增加而升高；結合水量不變的條件下，游離水含量變化對酶的催化活性影響不大。關鍵因素水活度（wateractivity，Aw）：是指體系中水的逸度與純水逸度之比。通常用體系中誰的蒸氣壓與相同條件下純水的蒸氣壓之比表示。Aw=P/P0P為一定條件下體系中水的蒸氣壓；P0為相同條件下純水的蒸氣壓。酶的催化反應速度隨水活度的增加而先升高后降低的趨勢；到達某一點時，酶的催化反應速度達到最大，稱為最適水活度。小結最適水含量隨著溶劑極性增加而增加；最適水活度與溶劑極性大小沒有關系；采用水活度作為參數(shù)來研究有機介質(zhì)中水對酶催化作用的影響更為確切。（三）有機溶劑對酶催化反應的影響常用的有機溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。酶的結構和功能酶的催化活性底物和產(chǎn)物的分配本章目錄1.對酶的結構和功能的影響在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以較好地保持其完整的空間結構。在有機溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進行催化反應。根據(jù)酶分子和有機溶劑的特性不同，保持其空間結構完整性的情況也有所差別。2.對酶的催化活性的影響極性較強的有機溶劑（如甲醇、乙醇等），會奪取酶分子的結合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性，甚至引起酶的變性失活。極性系數(shù)lgP表示有機溶劑極性的強弱。P是指溶劑在正辛烷與水兩相中的分配系數(shù)。因此應選擇好所使用的溶劑，控制好介質(zhì)中的含水量，或者經(jīng)過酶分子修飾提高酶分子的親水性，避免酶在有機介質(zhì)中因脫水作用而影響其催化活性。正己烷可奪走酶分子0.5%的結合水；甲醇可奪走酶分子60%的結合水；例如3.對底物和產(chǎn)物的分配的影響有機溶劑與水之間的極性不同，在反應過程中會影響底物和產(chǎn)物的分配。酶的作用底物——必需水層——活性中心；反應產(chǎn)物——必需水層——有機溶劑；一般選用2≤lgP≤5的有機溶劑為宜。第三節(jié)

酶在有機介質(zhì)中的催化特性

酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，由于有機溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結構、活性中心的結合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性。底物特異性立體選擇性區(qū)域選擇性鍵選擇性熱穩(wěn)定性底物特異性酶在水溶液中進行催化反應時，具有高度的底物專一性。在有機介質(zhì)中，酶分子活性中心的結合部位與底物之間的結合狀態(tài)發(fā)生改變。如胰蛋白酶催化N-乙酰-L-絲氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯。不同極性的有機介質(zhì)，酶的底物專一性不同。立體選擇性對映體選擇性（enantioselectivity）：酶在對稱的外消旋化合物中識別一種異構體的能力大小的指標。立體選擇系數(shù)KLD，系數(shù)越大，酶催化的對映體選擇性越強。在水溶液中較強，在疏水性強的有機介質(zhì)中較差。如胰蛋白酶催化N-乙酰丙氨酸氯乙酯水解。區(qū)域選擇性Regioselectivity：酶能夠選擇底物分子中某一區(qū)域的基團優(yōu)先進行反應。區(qū)域選擇系數(shù)Krs，系數(shù)越大，表明酶優(yōu)先作用于某個基團。不同的有機介質(zhì)，區(qū)域選擇系數(shù)相差較大。如脂肪酶催化1,4-二丁?；?2-辛基苯與丁醇的轉(zhuǎn)酯反應。甲苯—C4；乙腈—C1。鍵選擇性在同一底物分子中，有2種以上的化學鍵都可以與酶反應時，酶對其中一種化學鍵優(yōu)先反應。與酶的來源和有機介質(zhì)的種類有關。黑曲霉脂肪酶——羥基?；?；毛霉脂肪酶——氨基酰化。熱穩(wěn)定性由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關,因此，在有機介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性顯著提高。由于有機溶劑的存在,水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基轉(zhuǎn)移等。某些酶在有機介質(zhì)與水溶液中的熱穩(wěn)定性

酶

介質(zhì)條件

熱穩(wěn)定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯水，pH7.0T1/2<26hT1/2<2min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2=1.5hT1/2<2min脂蛋白脂肪酶甲苯，90℃，400h活力剩余40％胰凝乳蛋白酶正辛烷，100℃水，pH8.0,55℃T1/2=80minT1/2=15min枯草桿菌蛋白酶正辛烷，110℃T1/2=80min核糖核酸酶壬烷，110℃，6h水，pH8.0,90℃活力剩余95％T1/2<10min酸性磷酸酶正十六烷，80℃水，70℃T1/2=8minT1/2=1min腺苷三磷酸酶(F1-ATPase)甲苯，70℃水，60℃T1/2>24hT1/2<10min限制性核酸內(nèi)切酶（HindⅢ）正庚烷，55℃，30d活力不降低β-葡萄糖苷酶2-丙醇，50℃，30h活力剩余80％溶菌酶環(huán)己烷，110℃水T1/2=140minT1/2=10min本章目錄第四節(jié)

有機介質(zhì)中酶催化反應的類型和影響因素酶在有機介質(zhì)中可以催化多種反應，主要包括：合成反應轉(zhuǎn)移反應醇解反應氨解反應異構反應氧化還原反應裂合反應本章目錄主要應控制的條件：酶的種類和濃度底物的種類和濃度有機溶劑的種類水含量溫度pH離子強度第五節(jié)

酶非水相催化的應用

酶催化反應應用

脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機酸合成酯類轉(zhuǎn)酯各種酯類生產(chǎn)聚合二酯的選擇性聚合?；蚀嫉孽；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羥基化膽固醇氧化酶氧化膽固醇測定醇脫氫酶酯化有機硅醇的酯化手性藥物的拆分手性化合物：是指化學組成相同，而其立體結構互為對映體的兩種異構體化合物。目前世界上化學合成藥物中約40%屬于手性藥物。單一對映體藥物占絕大多數(shù)。對映體之間的藥理、藥效差異較大。手性藥物兩種對映體的藥理作用

藥物名稱有效對映體的作用另一種對映體的作用普萘洛爾（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羥基苯哌嗪(Dropropizine)反應停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速寧（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛爾（Kebivolol）S構型，治療心臟病,β-受體阻斷劑S構型，消炎、解熱、鎮(zhèn)痛S構型，抗關節(jié)炎S構型，鎮(zhèn)咳S構型，鎮(zhèn)靜劑S構型，消炎S構型，擴張支氣管S,S構型，抗結核病右旋體，治療高血壓,β-受體阻斷劑R構型，鈉通道阻滯劑R構型，療效很弱R構型，突變劑R構型，有神經(jīng)毒性R構型，致畸胎R構型，防治牙周病R構型，抑制血小板凝集R,R構型，致失明左旋體，舒張血管一種顯著療效，另一種療效很弱或無療效；一種有療效，另一種有毒副作用；兩種對映體的藥效相反；兩種對映體具有不同藥效；兩種消旋體的作用具有互補性；前4種類型其藥理、藥效有很大不同。第5種，使用消旋體為好。1992年，美國FDA明確要求對于具有手性特性的化學藥物，都必需說明其兩個對映體在體內(nèi)的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動力學情況。許多國家和地區(qū)也都制定了有關手性藥物的政策和法規(guī)，大大推動了手性藥物拆分的研究和生產(chǎn)應用。1.脂肪酶-位置選擇性酯化反應葡萄糖苷-6-O-?；苌锸且环N可生物降解的非離子表面活性劑，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下進行選擇性酯化得到：手性高分子聚合物的制備2.糖酯的合成脂肪酶-消旋化合物選擇性酯化以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸為原料，在有機溶劑介質(zhì)中用脂肪酶(CCL)或豬肝酯酶（PLE）催化酯化反應，可得到較高光學純度的R-或S-酯。發(fā)