外泌體提取技術(shù)及其在疾病診斷中的應(yīng)用,病理學(xué)論文

外泌體提取技術(shù)及其在疾病診斷中的應(yīng)用,病理學(xué)論文摘要：外泌體是由多囊體經(jīng)胞吐作用釋放出來(lái)的直徑30～150nm小泡體。外泌體由人體各種細(xì)胞分泌，其內(nèi)含有來(lái)自細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等成分，介入人類疾病的發(fā)生發(fā)展經(jīng)過(guò)。尤其是介入或介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移、耐藥、免疫逃逸、細(xì)胞凋亡。外泌體有望作為疾病診斷、預(yù)后分析、監(jiān)測(cè)追蹤的生物標(biāo)記物，治療靶點(diǎn)或藥物載體，并為疾病的診斷、治療、預(yù)后分析、監(jiān)測(cè)追蹤提供新思路及方式方法。本文綜述了外泌體的生物學(xué)特性、提取方式方法及其在人類不同疾病中的應(yīng)用潛能。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：外泌體;生物學(xué)特性;分離方式方法;生物標(biāo)記物;診斷;Abstract：Exosomesaresmallvesicularbodies(30nmto150nmindiameter)releasedbyexocytosisofmultivesicularbodies(MVBs).Exosomesaresecretedbyvariouscellsofthehumanbody,whichcontainproteins,nucleicacidsandlipidsfromcellsandparticipateintheoccurrenceanddevelopmentofhumandiseases.Inparticular,theyparticipateinormediatethegrowth,invasionandmigration,drugresistance,immuneescape,andapoptosisoftumorcells.Exosomesareexpectedtobeusedasbiomarkersfordiseasediagnosis,prognosisanalysis,monitoringandtracking,therapeutictargetsordrugcarrier,andprovidenewideasandmethodsforthediagnosis,treatment,prognosisanalysis,monitoringandtrackingofdiseases.Thisarticlereviewsthebiologicalcharacteristicsandextractionmethodsofexosomesandtheirapplicationpotentialindifferenthumandiseases.Keyword：Exosomes;Biologicalcharacteristics;Separationmethods;Biomarkers;Diagnosis;外泌體(exosome)是細(xì)胞分泌的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡樣體，它的直徑30～150nm，是一種膜囊泡，來(lái)源于體內(nèi)各種活細(xì)胞分泌的晚期核內(nèi)體(多囊泡體)。它廣泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁、胃液、胸水、腦脊液、腹腔和胸腔積液等多種體液中，含有蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物活性物質(zhì)，可通過(guò)生理屏障，介入細(xì)胞間物質(zhì)交換及信息溝通，在各種生理和病理經(jīng)過(guò)中發(fā)揮著重要作用[1,2,3,4,5]。隨著研究的不斷深切進(jìn)入，對(duì)外泌體中蛋白、核酸和脂類檢測(cè)將有助于疾病的早期診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后分析[2,3,4,5]。因而，本文綜述了外泌體在人類疾病中的研究進(jìn)展，以期為不同疾病的早期診斷及治療、預(yù)后分析和監(jiān)測(cè)追蹤提供新思路及方式方法。1、外泌體的生物學(xué)特性外泌體是由含有膜蛋白的脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成的小囊泡，其內(nèi)含有蛋白、核酸、脂質(zhì)等物質(zhì)。外泌體主要含有下面蛋白：(1)四跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82);(2)膜運(yùn)輸和融合蛋白(GTPase、Rab蛋白、膜聯(lián)蛋白、脂質(zhì)筏標(biāo)志性蛋白)；(3)介入多囊體生物合成相關(guān)蛋白(Alix蛋白、TSG101);(4)熱休克蛋白(HSPs，如Hsp60、Hsp70、Hsp90);(5)脂質(zhì)相關(guān)蛋白、磷脂酶；(6)細(xì)胞骨架蛋白(肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和膜突蛋白)[1,2,3]。外泌體攜帶大量核酸物質(zhì)，包括miRNA、mRNA、DNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、核糖體RNA及轉(zhuǎn)運(yùn)RNA等[4,6]。外泌體主要包含下面脂質(zhì)[1]:(1)脂筏相關(guān)脂質(zhì)(如膽固醇)；(2)鞘脂(如鞘磷脂和神經(jīng)酰胺)；(3)磷脂；(4)甘油磷脂類(如磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸)。外泌體構(gòu)成及發(fā)揮作用的經(jīng)過(guò)大致為下面幾個(gè)步驟：首先分泌外泌體的細(xì)胞通過(guò)本身細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷吞噬本身細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)(核酸、蛋白等)構(gòu)成早期內(nèi)體。然后早期內(nèi)體發(fā)育成成熟的內(nèi)體，并通過(guò)微粒體膜向內(nèi)出芽構(gòu)成多囊泡內(nèi)體。在某些機(jī)制作用下，多囊泡內(nèi)體與細(xì)胞膜融合，內(nèi)部囊泡在被釋放到細(xì)胞外構(gòu)成外泌體。釋放的外泌體可通過(guò)細(xì)胞吞飲作用和細(xì)胞膜融合等方式進(jìn)入靶細(xì)胞，或者通過(guò)其外表配體與靶細(xì)胞外表受體相結(jié)合，影響靶細(xì)胞的代謝經(jīng)過(guò)、信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表示出等。2、外泌體提取方式方法2.1、超速離心分離該方式方法是基于外泌體的大小，使用超速離心進(jìn)行外泌體的分離提取。主要提取經(jīng)過(guò)是：⑴樣本以300g離心10min，去除沉渣收集上清液，以去除活細(xì)胞及較大的雜質(zhì)；⑵收集的上清液依次以2000g離心10min和10000g離心30min，均去除沉渣收集上清液，以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片；⑶將最終收集到的上清液以100000g超高速離心70min，去除上清液以收集沉淀，將沉淀以100LPBS重懸純化提取[7,8]。超速離心是研究人員最常用的方式方法，其優(yōu)勢(shì)主要是適用于各種類型的外泌體提取(細(xì)胞培養(yǎng)液、胸水積液、血清、尿液等)。但超速離心法存在下面缺乏之處：⑴完成屢次離心需要消耗大量時(shí)間，不合適臨床快速應(yīng)用；⑵需要樣本量較大；⑶超高速離心容易使得外泌體破裂導(dǎo)致外泌體量更少。2.2、蔗糖梯度離心法該方式方法是基于外泌體的大小和密度，使用超速離心和蔗糖密度梯度進(jìn)行外泌體的分離提取。外泌體能夠在蔗糖密度梯度溶液中富集，密度范圍為1.13～1.21g/mL。使用這種方式方法已經(jīng)成功從條件培養(yǎng)基、體液和組織中分離出外泌體[8,9]。主要提取經(jīng)過(guò)是：前面的步驟與超速離心法分離提取方式方法一樣，只是在100000g超高速離心時(shí)參加30%蔗糖緩沖液用于進(jìn)一步純化分離外泌體。該方式方法的優(yōu)點(diǎn)是提取的外泌體純度更高層次，但是該方式方法不但有與超高速離心一樣的缺點(diǎn)而且步驟愈加復(fù)雜，不合適大規(guī)模應(yīng)用。2.3、超濾該方式方法是基于不同孔徑的膜分離并提取外泌體。主要提取經(jīng)過(guò)是：利用不同截留相對(duì)分子質(zhì)量的超濾膜對(duì)樣品進(jìn)行選擇性分離，便可獲得外泌體。該方式方法具有提取高純度外泌體的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是洗脫效率低[10]。2.4、尺寸排阻液相色譜法該方式方法是基于凝膠孔隙的孔徑與樣品的分子大小的相對(duì)關(guān)系分離溶質(zhì)的分析方式方法[11]。主要提取經(jīng)過(guò)是：利用尺寸排除柱含有不同直徑納米孔徑的樹(shù)脂，蛋白質(zhì)和其他較小的污染分子的通過(guò)延遲，而較大的囊泡能夠快速通過(guò)并在空隙體積中洗脫。該方式方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠防止外泌體生物功能喪失。缺點(diǎn)是工作量大，不合適大樣本的處理。2.5、免疫親和珠分離法該方式方法是基于外表標(biāo)志物的表示出吸附、分離外泌體。主要提取經(jīng)過(guò)是：涂有抗靶抗體的磁珠標(biāo)記吸附具有靶抗體的外泌體[12]。該方式方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)外泌體的捕獲更具有親和力和特異性。缺點(diǎn)是它只能用于提取高表示出靶抗體的外泌體。2.6、ExoQuick提取法該方式方法是根據(jù)聚合物共沉淀原理。這些試劑通常會(huì)降低外泌體的水化作用(進(jìn)而降低溶解性)，進(jìn)而導(dǎo)致沉淀。主要提取經(jīng)過(guò)是：樣品以3000g離心15min，取上清；將上清過(guò)0.22m一次性濾器，根據(jù)試劑要求步驟將得到的上清夜參加沉淀劑(4:1)，混均勻，然后在4℃放置30min；將孵育好的樣品以1500g離心5min，棄上清，沉淀以100LPBS重懸純化提取。該方式方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，外泌體提取效率高。缺點(diǎn)是成本高，不合適大規(guī)模的樣品處理[13]。3、外泌體在人類不同疾病中的研究進(jìn)展3.1、外泌體蛋白的研究進(jìn)展由于外泌體中的白介素是一種集中表示出于胃腸道部位的糖蛋白，因而其對(duì)胃腸道疾病的影響相當(dāng)宏大，研究表示清楚從炎癥性腸病(包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病)患者的腸道提取分離的外泌體中腫瘤壞死因子-和白介素-10、白介素-6、白介素-8的水平更高層次，并且都與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[14]。外泌體中的淀粉前體蛋白(APP)是一類廣泛存在各種組織中，且集中表示出于神經(jīng)元突觸部分的膜蛋白質(zhì)。新近的研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病中一部分-淀粉樣蛋白由外泌體分泌，并且外泌體特異性蛋白在阿爾茨海默患者的斑塊中被發(fā)現(xiàn)[15]。PERETS等[16]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)腦部疾病(包括阿爾茨海默病、帕金森病和中風(fēng))具有特異性、靶向性和累積性。把外泌體靶向遞送siRNA的BACE1抑制導(dǎo)致野生型小鼠的腦-淀粉樣蛋白水平顯著降低，而B(niǎo)ace1介導(dǎo)的-淀粉樣蛋白斑塊構(gòu)成與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[17]。在癌癥疾病中，外泌體中的各種成分蛋白質(zhì)不管對(duì)癌癥診斷還是對(duì)癌癥用藥的靶向治療均具有宏大的潛在價(jià)值。癌癥患者外泌體的蛋白含量顯著高于健康人群。MELO等[18]通過(guò)大量的胰腺癌患者血清樣本發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，胰腺癌患者血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)陽(yáng)性的外泌體占比顯著增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌患者血清中GPC1陽(yáng)性外泌體豐度顯著高于正常人，該發(fā)現(xiàn)為胰腺癌的早期診斷提供了非常重要的基礎(chǔ)。HANNAFON等[19]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中外泌體含有轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis-associatedprotein1,MTA1)，并可將其轉(zhuǎn)移至其他細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中缺氧和雌激素受體信號(hào)發(fā)生轉(zhuǎn)變。這表示清楚外泌體MTA1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移通能過(guò)修飾重要信號(hào)通路的細(xì)胞應(yīng)答來(lái)促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展，表示清楚外泌體MTA1能夠作為乳腺癌的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。HOSHINO等[20]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同器官傾向性的腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有不同的整合素表示出譜。整合素61和64介入肺轉(zhuǎn)移，而整合素v5介入肝轉(zhuǎn)移，整合素64和v5的敲除減少了靶器官細(xì)胞獲得的外泌體，進(jìn)而分別減少了肺和肝轉(zhuǎn)移。最后，通過(guò)臨床數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)外泌體整合素蛋白可用作預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的血漿外泌體黏蛋白1(MUC1)水平是健康人的1.5倍，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示清楚MUC1被選擇性地富集在外泌體中[21]，可能是診斷非小細(xì)胞肺癌的敏感生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體中AHSG(alpha-2-HS-glycoprotein)和ECM1(extracellularmatrixprotein1)與健康人相比明顯高表示出，聯(lián)合檢測(cè)血漿外泌體AHSG、ECM1和癌胚抗原提高了診斷NSCLC的價(jià)值[22]。近年來(lái)，外泌體作為一種免疫原性低、生物相容性高、給藥效率高的藥物給藥系統(tǒng)而出現(xiàn)。氨基乙基乙醇胺(AA)是受體的高親和力配體，已被用于靶向遞送多柔比星(DOX)、蛋白質(zhì)藥物和siRNA。KIM等[23]開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了一種含有氨基乙基乙醇胺-聚乙二醇(AA-PEG)載體修飾裝載有抗癌藥物紫杉醇(PTX)的外泌體以靶向肺癌細(xì)胞過(guò)度表示出的受體AA-PEG載體外泌體負(fù)載PTX(AA-PEG-Exptx)具有較高的承載能力，系統(tǒng)給藥后在癌細(xì)胞中積累能力強(qiáng)，治療效果明顯改善。靶向性與外泌體類藥物的生物相容性相結(jié)合，為抗癌治療提供了一個(gè)強(qiáng)大而新穎的載體。3.2、外泌體核酸的研究進(jìn)展miRNA是外泌體核酸的主要組成成分，miRNA可選擇性組裝到Exosomes中，然后穩(wěn)定存在于患者的血液、尿液和其他體液中。miRNA的數(shù)量和組成在患者和正常人中存在差異，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為疾病診斷的標(biāo)記物。外泌體miRNA在癌癥疾病的相關(guān)研究已相當(dāng)深切進(jìn)入，在癌癥疾病診斷方面的潛在價(jià)值已經(jīng)有很多新近研究證實(shí)。ENDZELI??等[24]發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)血漿外泌體中miR-200c-3p和miR-21-5p的水平能夠區(qū)分出前列腺癌和前列腺增生患者；血漿外泌體中Let-7a-5p水平能夠區(qū)分Gleason評(píng)分8分和6分的前列腺癌患者。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管癌患者中的外周血外泌體microRNA-10b、miR-30c、miR-21和miR-181a高表示出和miR-let7a低表示出能夠很好地將胰腺導(dǎo)管癌與慢性胰腺炎患者及正常對(duì)照志愿者區(qū)分開(kāi)[25]。而且近期研究表示清楚，非小細(xì)胞肺癌中的腺癌特異性外泌體miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p與鱗狀細(xì)胞癌特異性外泌體miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b能夠作為鑒別腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤源性外泌體生物標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)血漿中特異性外泌體有希望成為非小細(xì)胞肺癌早期診斷的高敏感性非侵入性方式方法[26]。而在癌癥疾病的發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中，外泌體miRNA也起到至關(guān)重要的作用，其介入腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移各個(gè)方面，也正由于它的這種特性，其在腫瘤治療方面也有不可估量的價(jià)值。CASABEI等[27]發(fā)如今脂肪肉瘤的外泌體中miR-25-3p和miR-92a-3p通過(guò)TLR7/8依靠性方式刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL6，并通過(guò)與周圍微環(huán)境的互相作用促進(jìn)脂肪肉瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)星形細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-335-5p，在體外和體內(nèi)均可被肝細(xì)胞性肝癌的癌細(xì)胞攝取，進(jìn)而抑制體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并誘導(dǎo)體內(nèi)肝細(xì)胞癌的瘤體縮小[28]，該研究為肝癌的潛在治療策略提供了線索。同時(shí)在非腫瘤性疾病中如炎癥及心血管疾病，外泌體中的miRNA也起到不可忽視的作用。EBRA-HIMKANI等[29]對(duì)多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis,MS)患者與健康對(duì)照組的血漿外泌體多種miRNA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA不僅能夠作為診斷MS的生物標(biāo)志物，而且在預(yù)測(cè)疾病亞型方面具有很高的準(zhǔn)確性。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)從血管平滑肌細(xì)胞中分離出的外泌體過(guò)表示出KLF5，是平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的啟動(dòng)子。這些外泌體含有miR-155，被內(nèi)皮細(xì)胞吸收后通過(guò)抑制內(nèi)皮屏障功能，進(jìn)而促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的構(gòu)成及進(jìn)展[30]。3.3、外泌體脂質(zhì)的研究進(jìn)展外泌體的脂質(zhì)主要包括神經(jīng)酰胺、鞘脂、膽固醇和甘油磷脂等，外泌體脂質(zhì)由于其脂溶性的特性，因而其更好的穿透各種生物屏障，因而其在泌尿疾病診療方面有不可估量的潛能。SKOTLAND等[31]采用高通量質(zhì)譜定量脂質(zhì)體分析方式方法對(duì)前列腺癌患者和健康對(duì)照者尿外泌體脂質(zhì)組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9種外泌體脂類的水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，華而不實(shí)乳糖酰神經(jīng)酰胺和磷脂酰絲氨酸(PS)最高，結(jié)果提示尿液外泌體中脂質(zhì)類物質(zhì)有望作為前列腺癌的生物標(biāo)志物。DELBOCCIO等[32]利用脂質(zhì)組學(xué)研究的微LC-Q-TOF-MS平臺(tái)研究尿液外泌體脂質(zhì)的全部特征。通過(guò)健康對(duì)照組和腎細(xì)胞癌患者尿液外泌體脂質(zhì)的比擬分析，初步鑒定了腎細(xì)胞癌尿外泌體的脂質(zhì)組成差異，揭示了尿液外泌體脂質(zhì)組成與腎細(xì)胞癌的關(guān)系。研究表示清楚前列腺癌患者與正常人比擬，外泌體脂質(zhì)總量增加了1.5～2倍，直徑150nm比直徑150nm的外泌體增加幅度更大。另外研究還發(fā)現(xiàn)中性脂質(zhì)如二?；视秃腿８视驮谒型饷隗w中都會(huì)減少并且不依靠于外泌體的大小；尿液外泌體脂質(zhì)分析有望成為鑒別前列腺癌生物標(biāo)志物[33]。4、結(jié)束語(yǔ)綜上所述，外泌體的研究及應(yīng)用仍存在下面缺乏：其一，當(dāng)前對(duì)外泌體分離及鑒定等相關(guān)技術(shù)仍不適用于臨床大規(guī)模應(yīng)用，研發(fā)出高效特異的外泌體分離和鑒定技術(shù)是解決外泌體臨床應(yīng)用的關(guān)鍵；其二，外泌體具備靶向特定器官或組織的潛能，有望通過(guò)促進(jìn)或抑制外泌體的分泌來(lái)治療疾病，然而，外泌體具有雙重或多元效應(yīng)，不同來(lái)源或載有不同核酸和蛋白的外泌體對(duì)同一類型腫瘤細(xì)胞有著雙重影響，甚至一樣來(lái)源的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲作用并不一致，其作用機(jī)制及對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響仍有很多問(wèn)題亟待解決；其三，外泌體具有成為治療藥物載體的宏大潛力，然而外泌體產(chǎn)量低，會(huì)被肝臟的巨噬細(xì)胞快速去除，以及將功能分子或抗癌藥物加載到外泌體制備成靶向藥物的研發(fā)工作才剛剛起步，這些都是日后需要解決的難題。外泌體含有來(lái)自細(xì)胞的分子，攜帶的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)介入了人類疾病的發(fā)生發(fā)展經(jīng)過(guò)，介入或介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移、耐藥、免疫逃逸、細(xì)胞凋亡等。外泌體有望成為疾病診斷、預(yù)后分析、監(jiān)測(cè)追蹤的生物標(biāo)記物，治療靶點(diǎn)或藥物載體，并為疾病的治療、預(yù)后分析、監(jiān)測(cè)追蹤提供新思路及方式方法，這些都是外泌體研究領(lǐng)域的熱門，值得進(jìn)一步深切進(jìn)入研究。以下為參考文獻(xiàn)[1]RECORDM,CARAYONK,POIROTM,etal.Exosomesasnewvesicularlipidtransportersinvolvedincell-cellcommunicationandvariouspathophysiologies[J].BiochimBiophysActa,2020,1841(1):108-120.[2]RUIVOCF,ADEMB,SILVAM,etal.Thebiologyofcancerexosomes:insightsandnewperspectives[J].CancerRes,2021,77(23):6480-6488.[3]WANZ,GAOX,DONGY,etal.Exosome-mediatedcell-cellcommunicationintumorprogression[J].AmJCancerRes,2021,8(9):1661-1673.[4]SCHWARZENBACHH,HOONDS,PANTELK.Cell-freenucleicacidsasbiomarkersincancerpatients[J].NatRevCancer,2018,11(6):426-437.[5]ROMA-RODRIGUESC,RAPOSOLR,CABRALR,etal.Tumormicroenvironmentmodulat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