基因的重組與轉(zhuǎn)移

基因的重組與轉(zhuǎn)移第一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章

基因的重組與轉(zhuǎn)移

第二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)

DNA片段的體外連接第四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日1.兩段DNA的連接依靠粘性末端第五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日2.DNA片段與載體的連接依靠粘性末端第六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日第七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日l(shuí)igasenick第八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的10%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

第九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法

2.人工加尾形成

“粘性末端”

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒(méi)有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片段加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)第十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來(lái)目的基因和載體加尾長(zhǎng)度不同，需補(bǔ)齊；不能把插入片段再切下來(lái)。非酶切位點(diǎn)第十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

第十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

第十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來(lái)。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：第十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日（3）DNA接頭

(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用第十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接第十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接第十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-第二十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘HO-GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG-OH5’

5’HO-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-OH5’

切口切口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有切口，但仍然能與DNA片段連接。第二十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5’端多余的3~5bp起保護(hù)堿基作用）避免與所擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。第二十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日引物1GCAGAATTC

互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’

GCAGAATTC

互補(bǔ)序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互補(bǔ)序列

PCR產(chǎn)物5’--3’

3’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

第二十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’

3-’

5’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物

互補(bǔ)序列-5’

3’-引物2第二十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！第二十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）平末端載體兩個(gè)3’端各加一個(gè)T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體3’端上添加T！第二十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA第二十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。第二十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。第二十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第三十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片段EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第三十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量連接反應(yīng)體系中，插入片段比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片段以單鏈連接。5’

3’

載體插入片段第三十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）第三十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日17第三十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第二節(jié)

重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第三十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種第三十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第三十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日4.制備過(guò)程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存（15%甘油）用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第三十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。第四十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法

2.轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第四十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第四十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日LB培養(yǎng)受體菌至OD600冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNA

Onice混合加入1mL培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第四十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過(guò)夜第四十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒

5.影響轉(zhuǎn)化率的因素第四十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日①生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須梯度融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞

（competentcells)第四十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過(guò)受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第四十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。S和R是控制寄主細(xì)菌發(fā)生溶菌作用的兩個(gè)基因，故稱溶菌基因。第四十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白活性阻遏蛋白失活44℃—45℃DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃第四十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）

互補(bǔ)型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2第五十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日(5)體外包裝過(guò)程

第五十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

轉(zhuǎn)導(dǎo)

第五十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。第三節(jié)

外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第五十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化第五十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化第五十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤法（leafdisk)第五十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV電壓擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)第五十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日外源基因選擇標(biāo)記基因電擊通過(guò)膜上的小孔吸入DNADNA進(jìn)入細(xì)胞核選擇穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞擯棄不表達(dá)或表達(dá)不穩(wěn)定的細(xì)胞第五十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）第五十九頁(yè)，