醫(yī)學(xué)科研課題開(kāi)題報(bào)告

醫(yī)學(xué)科研課題開(kāi)題報(bào)告立題依據(jù)（科學(xué)意義及國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析及參考文獻(xiàn)）惡性黑色素瘤是一種高度惡性且最具侵襲性的癌之一，多發(fā)生于皮膚，早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。對(duì)放、化療不敏感，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率增高，人們一直在期待著可以征服惡性黑素瘤的新的療法的出現(xiàn)!最近大量的數(shù)據(jù)表明惡性腫瘤的發(fā)展與T-鈣粘蛋白的表達(dá)變化相關(guān).T-鈣粘蛋白已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌［1-3］、胃癌、胰腺癌、卵巢癌［4-9］等多種惡性腫瘤中被檢測(cè)到表達(dá)減少.最近的研究表明T/H鈣粘蛋白在乳腺癌中的重新表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能［1］.T/H鈣粘蛋白這個(gè)新型鈣粘蛋白分子在人類(lèi)許多癌細(xì)胞中表達(dá)都降低表明它或許在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］及維持正常細(xì)胞的表型中起重要作用［11］.T/H鈣粘蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，也許它會(huì)為腫瘤的診斷和治療帶來(lái)新的契機(jī).T-鈣粘蛋白是否對(duì)惡性黑色素瘤也有作用，目前還沒(méi)有相關(guān)研究的報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行相關(guān)方面的探討性研究!研究?jī)?nèi)容及預(yù)期成果（說(shuō)明具體研究?jī)?nèi)容、創(chuàng)新點(diǎn)及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題、預(yù)期成果及提供形式）研究?jī)?nèi)容：第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況第二部分T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建第三部分：T-cadherin基因的真核表達(dá)及生物活性分析創(chuàng)新點(diǎn)：首次將T-cadherin基因轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題：通過(guò)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出T-cadherin的基因全長(zhǎng)。預(yù)期成果及提供形式：觀(guān)察T-鈣粘蛋白在正常皮膚組織細(xì)胞、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況!進(jìn)一步闡明T-鈣粘蛋白作用機(jī)制T-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染入黑色素瘤細(xì)胞后觀(guān)察對(duì)其增殖和轉(zhuǎn)移活性的抑制情況，探索臨床診斷和治療黑色素瘤及其它腫瘤的方法!研究方案(包括研究方法、技術(shù)路線(xiàn)、研究進(jìn)度安排)研究方法：第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)材料：從正常人皮膚切取的痣組織，人黑色素瘤細(xì)胞株主要試劑和溶液第一抗體：兔抗人T-cadherin抗體第二抗體：生物素標(biāo)記羊抗兔IgG三抗：鏈親和霉素標(biāo)記HRP設(shè)備方法冷凍切片的免疫染色程序活細(xì)胞的免疫染色程序熒光顯微鏡檢注意：為保證結(jié)果的可靠性應(yīng)該同時(shí)設(shè)有對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照(正常組織);陰性對(duì)照(PBS代替一抗)以證明抗體的特異性。第二部分T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建材料：組織和細(xì)胞菌株與質(zhì)粒工具酶試劑儀器方法引物的設(shè)計(jì)總RNA的提取：異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量，觀(guān)察所提RNA有無(wú)明顯降解；逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)：為了證實(shí)RT反應(yīng)的成功設(shè)管家基因GAPDH為內(nèi)對(duì)照PCR擴(kuò)增：利用上下游引物，在DNA聚合酶下對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR過(guò)程設(shè)B-actin為內(nèi)對(duì)照PCR產(chǎn)物的回收、純化PCR產(chǎn)物的克隆DNA序列測(cè)定真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒的鑒定和篩選質(zhì)粒的大量提取轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞第三部分：T-鈣粘蛋白基因的真核表達(dá)及生物活性分析材料方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)Western印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白的表達(dá)流式細(xì)胞周期分析凋亡的檢測(cè)技術(shù)路線(xiàn)圖：研究進(jìn)度安排：學(xué)習(xí)學(xué)位課程，查閱文獻(xiàn)，完成課題設(shè)計(jì)基本完成實(shí)驗(yàn)研究工作完成實(shí)驗(yàn)補(bǔ)遺工作并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，撰寫(xiě)論文論文答辯經(jīng)費(fèi)預(yù)算試劑費(fèi)用：1500元紐R》組織及細(xì)胞：100元論文打印費(fèi)：100元答辯費(fèi)：150元總計(jì)：19000元課題可行性分析已完成黑色素瘤及T-鈣粘蛋白研究最新進(jìn)展的文獻(xiàn)檢索和綜述報(bào)告工作。所有實(shí)驗(yàn)均在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚病研究室和中心實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)室的老師實(shí)驗(yàn)技術(shù)熟練，在細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化及分子生物學(xué)等方面都可給予指導(dǎo);實(shí)驗(yàn)所需的科研儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室均具備。參考文獻(xiàn):Toyooka,KO.,ToyookaS.,VirmaniAK.,SathyanarayanaUGetalCancerRes2015Jun1;61(11):455660Lee,S.W.,1996Nat.Med,2:776782Zhong,Y.,Y.Delgado.,J.Gomez,S.W.Leeetal2015ClinCancerRes.Takeuchi,M.,Misaki,A.,Chen,B.K.,etal(1999)Histopathology,35,87Kawakami,M.,Staub,J.,Cliby,W.,etal1999Int.J.Oncol.,15,715720

Sato,M.,Mori,Y.,Sakurada,A.,etal(1998)Hum.Genet.,43,285286Sato,M.,Mori,Y.,Sakurada,A.,etal(1998)Hum.Genet.,103,96101Mori,Y.,Matsunaga,M.,Abe,T.,etal(1999)BrJ.Cancer,80,556562Lee.S.W(1996)Nat.Med.,2,776782578Hung.Z.Y.,