鋅預(yù)處理對c-fos表達(dá)和動物行為學(xué)的影響,病理學(xué)論文

鋅預(yù)處理對c-fos表達(dá)和動物行為學(xué)的影響,病理學(xué)論文神經(jīng)病理性疼痛(neuropathypain,NPP)是由于感染、腫瘤和外傷等原因?qū)е轮袠谢蛲庵苌窠?jīng)系[1,2]統(tǒng)損傷后所引起的一種慢性疼痛狀態(tài).由于其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,而且鎮(zhèn)痛藥物的治療效果較差,因而,NPP已經(jīng)成為嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量的臨床頑癥之一,而研制更為有效的治療手段也成為學(xué)者[3]們的研究熱門.近年來的研究發(fā)現(xiàn),微量元素鋅似[4]乎與NPP密切相關(guān).因而,為了深切進(jìn)入研究鋅對NPP的影響,本文將c-fos蛋白和動物行為學(xué)作為觀察對象,利用原子吸收光譜技術(shù)、動物行為學(xué)檢測、免疫組化和圖像分析技術(shù)檢測鋅預(yù)處理對c-fos表示出和動物行為學(xué)的影響,進(jìn)而為揭示鋅影響NPP的機(jī)制提供理論根據(jù).1材料與方式方法1.1主要試劑與儀器兔抗小鼠多克隆c-fos抗體(cellsignaling公司);免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB染色劑(福州邁新公司);辣椒素(Santa公司);光學(xué)顯微鏡、原子吸收光譜儀、vonFrey刺激針和計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)等.1.2動物分組與模型制備48只C57/BL6小鼠,8周齡大,雌雄各24只,體重20~30g(北京維通利華實驗動物中心提供).將小鼠隨機(jī)分4組:采用右后足底注射辣椒素(0.5%,5l)制備NPP模型.①對照組(Con):給予適鋅飼料(鋅30mg/kg/d)喂養(yǎng)2周后,右側(cè)后足底注射溶劑(吐溫80、酒精和生理鹽水混合液);②適鋅喂養(yǎng)組(N-NPP):給予適鋅飼料(鋅30mg/kg/d)喂養(yǎng)2周后足底注射辣椒素;③低鋅喂養(yǎng)組(L-NPP):給予低鋅飼料(鋅0.85mg/kg/d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素;④高鋅喂養(yǎng)組(H-NPP)給予硫酸鋅水溶液(227mg/L/d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素.1.3取材與標(biāo)本制備、動物自主行為學(xué)觀察注射辣椒素后第7天,將小鼠用4%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,取腰5節(jié)段的脊髓,一部分稱重后,-80℃保存,用于原子吸收光譜技術(shù)檢測;另一部分放入4%多聚甲醛溶液固定12h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,制備5m厚的石蠟切片,用于免疫組織化學(xué)染色.從注射辣椒素前2天開場,天天觀察小鼠的行為學(xué)變化,觀察有無跛行、注射側(cè)后足不敢著地負(fù)重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、離地時間延長等現(xiàn)象,一直觀察到注射辣椒素后第7天.1.4機(jī)械痛閾檢測、原子吸收光譜技術(shù)注射辣椒素前2天和注射后第7天,將小鼠放在圍有透明玻璃的金屬網(wǎng)眼平臺上,等動物適應(yīng)環(huán)境后,用vonFrey刺沖動物右后足底.動物出現(xiàn)縮足和快速甩足等動作時以為是有反響;刺激針彎成90度而動物沒有抬足等反響則以為是無反響.10次當(dāng)中出現(xiàn)5次以上的縮足反響者視作陽性,機(jī)械性痛閾[5](g)就是能引起縮足反響的最小力度.足底注射辣椒素后第7天,取血清和脊髓組織.血清參加三氯醋酸,3000r/min離心5min,取上清;脊髓組織經(jīng)混合酸浸泡過夜后消化,利用原子吸收光譜分析法測定鋅含量.1.5免疫組織化學(xué)染色、圖像分析石蠟切片常規(guī)脫蠟入水,用微波進(jìn)行修復(fù).經(jīng)3%HO孵育10min,以封閉內(nèi)源性過氧化物酶;0.01M22PBS沖洗,5min3次;用正常非免疫動物血清孵育10min;甩掉血清,參加兔抗小鼠多克隆c-fos抗體(1:200),在4℃下孵育過夜;0.01MPBS沖洗,5min3次;參加山羊抗兔IgG(1:200),室溫下孵育10min;0.01MPBS沖洗,5min3次;參加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10min;0.01MPBS沖洗,5min3次;用DAB顯色5min,入水中止反響.切片常規(guī)脫水、透明和封片,光鏡下進(jìn)行觀察.用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照.用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析.每個樣本選取5張切片,每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行檢測,計算平均光密度值(averageoptical,AO).統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析(ANOVA)方式方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1原子吸收光譜檢測結(jié)果在注射辣椒素后7d,正常喂養(yǎng)組動物血清鋅和脊髓中的鋅含量均顯著減少(P0.01).低鋅喂養(yǎng)組動物血清鋅和脊髓鋅的含量更低;而高鋅喂養(yǎng)組動物的血清鋅和脊髓鋅含量最高P0.01,圖12).2.2小鼠行為學(xué)變化足底注射辣椒素后第1天小鼠即出現(xiàn)注射側(cè)后足跛行、不敢負(fù)重、經(jīng)常將后足縮至腹部或拖著后足行走,傷側(cè)腳趾外翻并攏,經(jīng)常舔足或甩足,活動度減少,明顯不如注射之前活潑踴躍,這種行為一直持續(xù)到觀察期末.華而不實,低鋅喂養(yǎng)組(L-NPP)小鼠行為學(xué)改變最為嚴(yán)重,而高鋅喂養(yǎng)組(H-NPP)小鼠的行為學(xué)改變最輕.機(jī)械痛閾檢測顯示:各組動物注射辣椒素后7天的機(jī)械痛閾顯著降低,痛敏加強(P0.01).華而不實,L-NPP組的機(jī)械痛閾最低,而H-NPP組的痛閾最高(P0.01,圖3).2.3免疫組化染色結(jié)果c-fos免疫組織化學(xué)陽性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀,主要表示出在脊髓神經(jīng)元的細(xì)胞核上.對照組動物在脊髓后角淺層有少量的陽性表示出產(chǎn)物,陽性細(xì)胞較少.與對照組相比,其它三組NPP動物的c-fos陽性表示出均增加,陽性細(xì)胞密集,平均光密度(AO)值增高(P0.01).華而不實,L-NPP組的陽性顆粒和陽性細(xì)胞最密集,AO值最高;H-NPP組的陽性顆粒和陽性細(xì)胞最稀疏,AO值最低(P0.01,圖4,5).3討論神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)受損傷所引發(fā)的一種慢性疾病,其發(fā)病原因多樣,包括:糖尿病等代謝系統(tǒng)疾病所引發(fā)的神經(jīng)痛、腫瘤侵襲等引發(fā)的神經(jīng)痛、腦和脊髓外傷等引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、[6-7]病毒感染和放化療所引發(fā)的神經(jīng)痛并發(fā)癥等.患者的主要臨床病理生理學(xué)表現(xiàn)是:痛覺過敏、痛覺超敏、自發(fā)性疼痛和異位痛等.近年來,由于社會老齡化日益嚴(yán)重,而且癌癥等疾病的生存率逐年提[8]高,導(dǎo)致NPP的發(fā)病率顯著增加,高達(dá)1%左右.由于這種疼痛劇烈而持久,可持續(xù)數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年,臨床上缺乏有效的治療方式方法,藥物治療往往還伴隨著成癮性等問題,因而,NPP已經(jīng)成為學(xué)者們密切關(guān)注的一大頑癥,而深切進(jìn)入討論NPP的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的治療靶點勢在必行.研究發(fā)現(xiàn),鋅是機(jī)體的一種重要的微量元素,[9]其廣泛分布于機(jī)體的各種組織和器官,在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的分布尤其豐富,華而不實,游離狀態(tài)的[10]鋅在神經(jīng)傳導(dǎo)活動中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用.[4]Nozaki等發(fā)現(xiàn),鋅是病理性疼痛的一種內(nèi)源性的抑制劑,能抑制在興奮性傳導(dǎo)經(jīng)過中起重要作用的NMDA受體,其與病理性疼痛的構(gòu)成與傳導(dǎo)密切相[11]關(guān).有報道稱,神經(jīng)損傷后,脊髓后角淺層的鋅離子顯著減少,伴隨動物的機(jī)械性痛閾降低,動物出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象,提示鋅可能介入了痛覺的產(chǎn)生與傳導(dǎo).另有研究發(fā)現(xiàn),鋅能抑制對NPP的產(chǎn)生具[12]有促進(jìn)作用的P物質(zhì)在脊髓的表示出;除此之外,鋅也能使痛閾升高,降低痛敏,提示鋅可能對病理性疼痛[13]具有抑制作用.本研究結(jié)果與之前的研究相符,我們利用原子吸收光譜技術(shù)和動物行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),NPP后,動物血清和脊髓中的鋅含量顯著減少,動物的機(jī)械痛閾降低,痛敏加強.高鋅喂養(yǎng)能改善血清和脊髓中的缺鋅狀態(tài),提高機(jī)械痛閾值,減輕痛敏;而低鋅喂養(yǎng)則加重血清和脊髓中的缺鋅狀態(tài),降低機(jī)械痛閾值,促進(jìn)痛覺過敏,提示,鋅對病理性疼痛具有抑制作用.那么鋅是怎樣抑制病理性疼痛的呢?研究發(fā)現(xiàn),原癌基因c-fos作為一種即刻早期基因,它能被第二信使誘導(dǎo),介入細(xì)胞內(nèi)信息傳遞經(jīng)過,在NPP時的表示出顯著增加,是神經(jīng)元激活的標(biāo)志,也[14]是痛覺過敏狀態(tài)發(fā)展的反映.研究發(fā)現(xiàn),在甲醛引起的炎性痛模型中,c-fos蛋白在脊髓表示出上調(diào),[15]熱痛閾降低;鞘內(nèi)給予c-fos反義寡核苷酸探針能顯著抑制福爾馬林和腰5脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠腰髓背角c-fos陽性神經(jīng)元的增加,提示c-fos的活化對于病理性疼痛的發(fā)展有顯著意義,而抑制其活化能緩[16]解慢性疼痛.本研究中,我們發(fā)現(xiàn),對照組動物在脊髓后角淺層c-fos只要少量陽性表示出,陽性細(xì)胞較少.注射辣椒素后,脊髓后角c-fos陽性表示出顯著增加,陽性細(xì)胞密集,AO值增高.高鋅喂養(yǎng)能使c-fos的表示出顯著下調(diào),AO值降低;而低鋅喂養(yǎng)能使c-fos的表示出更多,AO值增高,我們揣測鋅可能通過降低脊髓后角原癌基因c-fos的表示出進(jìn)而抑制了病理性疼痛的產(chǎn)生與傳導(dǎo),進(jìn)而使動物的機(jī)械痛閾顯著增高,痛敏降低.盡管我們的研究結(jié)果為研究鋅介入NPP的機(jī)制提供了一定的理論數(shù)據(jù),但是,鋅是通過如何的機(jī)制來抑制c-fos的表示出?鋅能否還通過其它的機(jī)制介入NPP的傳導(dǎo)?這些都有待于我們更深切進(jìn)入的研究.【以下為參考文獻(xiàn)】[1]SantoroD,SattaE,MessinaS,etal.Paininend-stagerenaldisease:afrequentandneglectedclinicalproblem[J].ClinNephrol,2020,79(1):S2-11.[2]JeongNY,ShinYH,JungJ.Neuropath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