藥品檢驗(yàn)操作規(guī)程

非無菌產(chǎn)品檢驗(yàn)操作規(guī)程一、微生物計(jì)數(shù)法1.供試液制備（1）水溶性樣品取供試品10g（ml），用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或TSB溶解或者稀釋制成1:10供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。（2）水不溶非油脂類供試品取供試品10g（ml），用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或TSB制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。（3）油脂類供試品取供試品10g（ml），加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的表面活性劑充分你混勻。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。2.計(jì)數(shù)方法（1）平皿法a：傾注法取制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的TSA或SDA,混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。b：涂布法取15～20ml溫度不超過45℃的TSA或SDA，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用的適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也相應(yīng)增加。每一平板表面接種的供試液不少于0.1ml。（2）薄膜過濾法取供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml、10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于TSA平板上；若測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于SDA平板上。3．抗菌活性的去除或滅活（1）增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。（2）加入適宜的中活劑或滅活劑。（3）采用薄膜過濾法。（4）上述幾種方法的聯(lián)合使用。二、控制菌檢查法陽性對(duì)照試驗(yàn)陽性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如果陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。耐膽鹽革蘭陰性菌供試液制備和預(yù)培養(yǎng)取供試品，用TSB作為稀釋劑照“微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液，混勻，在20～25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增值（約2小時(shí)）。a：定性試驗(yàn)除另有規(guī)定外，取相當(dāng)于1g或1ml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）腸道增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。b：定量試驗(yàn)選擇和分離培養(yǎng)取相當(dāng)于0.1g、0.01g、0.001g（或0.1ml、0.01ml、0.001ml）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）腸道增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。結(jié)果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表1查1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能數(shù)。表1耐膽鹽革蘭陰性菌的可能數(shù)（N）各供試品量的檢查結(jié)果每1g（或1ml）供試品中可能的菌數(shù)cfu0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++N＞103++-102＜N＜103+--10＜N＜102---N＜10注：（1）+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長；-代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上無菌落生長。（2）若供試品量減少10倍（0.01g或0.01ml、0.001g或0.001ml、0.0001g或0.0001ml），則每1g（或1ml）供試品中可能的菌落數(shù)（N）應(yīng)相應(yīng)增加10倍。EE（左：白草香解郁安神膠囊+大腸埃希菌，中：+大腸埃希菌，右：空白）VRBG平板(+大腸埃希菌)2.大腸埃希菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。結(jié)果判斷若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上無菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。陽性（MacB）3.沙門菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于TSI高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～48小時(shí)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。結(jié)果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且TSI的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或TSI的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。4.銅綠假單胞菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。取上述平板上生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。氧化酶試驗(yàn)將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N,N-二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。結(jié)果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上有菌落生長，且氧化酶試驗(yàn)陽性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長在但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。5.金黃色葡萄球菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種