核酸檢測(cè)技術(shù)及其在國(guó)內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用

核酸檢測(cè)技術(shù)及其在國(guó)內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用輸血相關(guān)傳染病的預(yù)防和掌握已經(jīng)成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn),技術(shù)的引進(jìn)是進(jìn)一步提高血液安全性的重要一環(huán)。本文就病原體核酸檢測(cè)技術(shù)(nucleicacidtesting,NAT)及其在國(guó)內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用狀況和結(jié)果作一介紹,并對(duì)該方法在我國(guó)推廣和應(yīng)用的必要性和可行性作初步探討。NAT酶免檢測(cè)(EIA)技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于血液篩檢,該方法的靈敏度和特異性也HBV、HCVHIV1∶66000、1∶1030001∶676000[1]。這些危急的主要緣由是:病毒感染者“窗口期”獻(xiàn)血,病毒變異,是指從感染病原開(kāi)頭,直至用某種檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到該病原存在為止的這一段HBsAg、抗-HIV、抗-HCV45-56ｄ22ｄ72ｄ[4,5],故美國(guó)90%以上輸血傳播HIVHBV75HCV[6]原或抗體血清學(xué)檢測(cè)不能有效地保障血液安全。NATNATHBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短9d(縮短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%[5,]NAT31504HCVRNANAT性疾病[9]。因此,NAT的引入可使輸血傳播疾病的危急性降到最低[10]。NAT1985年具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction,PCR)PCRNAT[11這些技術(shù)靈敏度和特異性或高或低,操作或簡(jiǎn)潔或簡(jiǎn)單,適合在各PCRTMAPCRDNA特異性和快速簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)得到了廣泛的應(yīng)用。通過(guò)簡(jiǎn)潔的技術(shù)改進(jìn)和聯(lián)合,涌現(xiàn)RNAPCR(RTPCR)、敏感性和特PCR)PCR、檢PCR(PCRELISA)、PCR酸探針雜交技術(shù)(PCRSSOP)PCRPCR目前在臨床檢測(cè)中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、DNAPCR參加濃度的內(nèi)標(biāo)或外標(biāo),便能進(jìn)展定量檢測(cè)。由于該方法實(shí)現(xiàn)了反響體系的全封閉和操作的全自動(dòng),不僅削減了污染,還提高了效率。雖然國(guó)內(nèi)很多生物技術(shù)企業(yè)已經(jīng)利用熒光PCRNAT止正式通過(guò)美國(guó)FDA2RocheCOBASAmpliHIV1/HCV,FDA50copies/ml>95%PCR20copies/ml般都很難滿足95%檢出低病毒載量標(biāo)本的要求。信任不斷提高檢測(cè)靈敏度,早日研發(fā)并注冊(cè)成功我國(guó)自己的NAT血液篩檢用試劑也是國(guó)內(nèi)生物技術(shù)企業(yè)的進(jìn)展目標(biāo)。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列依靠擴(kuò)增系統(tǒng)(nucleicacidｓsequencebased amplification,。TMA是一種利用Money鼠白血病病毒〔MMLV〕逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來(lái)擴(kuò)增RNA或DNA的反響系統(tǒng),主要擴(kuò)增原理為:目標(biāo)序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,以引物為引導(dǎo)進(jìn)展逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,轉(zhuǎn)錄出成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo)RNA序列,這些RNA又可以作為模板進(jìn)展下一個(gè)循環(huán),整個(gè)是一個(gè)自催化過(guò)程。NASBA的原理與TMA相像,只是在核酸提取和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強(qiáng),靈敏度高,反響條件簡(jiǎn)潔,擴(kuò)增效率高,無(wú)需特地的擴(kuò)增儀器,且因整個(gè)反響在1個(gè)試管中進(jìn)展,也削減了污染。NATDNAsignalamplificationassay,bDNA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)、連接酶鏈技術(shù)(ligasechainreaction,LCR)和鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacementamplification,SDA)等。這些技術(shù)或由于自身緣由,或由于剛研發(fā)出來(lái)尚未進(jìn)入bDNA1995年左右推出,其信號(hào)放大是通過(guò)堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的探針雜交結(jié)合到一個(gè)樹枝狀核酸枝狀體上而實(shí)現(xiàn)的。bDNADNAbDNA待測(cè)核酸,其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR,故該項(xiàng)技術(shù)實(shí)際上不適合用于血液篩檢,bDNAHBVHCVNAT在國(guó)內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用開(kāi)展NAT檢測(cè)的國(guó)家及所用的技術(shù)NAT在國(guó)外特別是一些興旺國(guó)家和地區(qū)已普遍應(yīng)用于血液篩檢[1例如,日本是世界HBV、HCV、HIVNAT[1]加坡、中NAT1997起就開(kāi)頭NAT2023NATFDANAT1：國(guó)家或地區(qū)技術(shù)混合檢測(cè)／單檢?Germany(1997國(guó)家或地區(qū)技術(shù)混合檢測(cè)／單檢?Germany(1997?PCR?Pool1999〕?Netherlands(1997〕?PCR?Pool?U.K.英國(guó)(2023〕?PCR?Pool?Switzerland?PCR?Pool?Japan日本(1997年１月起對(duì)原料?PCR?Pool漿；1999〕?PCR?pool?Canada?TMA/PCR?pool/IDT?韓國(guó)〔20231〕?USA(19993〕?TMA?IDTNewZealandTMApool/IDTAustraliaTMAIDTSingaporeTMAIDTPortugalTMA/PCRPool/IDTFrance(2023〕TMA/PCRPoolSpainTMA/PCRPoolItalyTMApoolHongKongTMA/PCRPool?臺(tái)灣〔2023〕?TMA/PCR?Pool各國(guó)承受的技術(shù)各不一樣〔參見(jiàn)表1。日本使用的方法為羅氏公司與日本NATＴＭNPX〔PCRHBV,HCVHIVChironTMATMA(ABC)系統(tǒng)則使用羅氏COBASAmpliScreen;荷蘭及局部歐洲國(guó)家將荷蘭阿克蘇公司推出的NucliesensCOBASAmpliScreen擴(kuò)增體系結(jié)合起QiagenScreen進(jìn)展評(píng)估,目的是尋求一種最適合的NAT技術(shù),既保障血液安全,又能保證血液的準(zhǔn)時(shí)供給,還要做到省時(shí)省力。NAT的血液安全水平已經(jīng)大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏檢概率仍舊2。1/34.8HIV-1NAT+1/34.8HIV-1NAT+6160121751/266.9國(guó)家試劑檢測(cè)方式NAT單獨(dú)陽(yáng)性檢出狀況文獻(xiàn)美國(guó)ChironProcleixChiron: 16人1999.03-2023.03:14TMAHIV-1/HCVassay;Roche Cobas發(fā)光檢測(cè)；Roche：24人份HCVNAT+：170/39,721,4041/23萬(wàn)；HIV-1NAT+12/37,164,054AmpliScreenHIV-1 and HCV混 合 ，PCR-ELISA1/310萬(wàn)tests日本 Multiplex1999711999.7–2023.4：文 獻(xiàn)HBV/HCV/HIV-1日-20231月HBVNAT+15,16reagent(Roche31日，500人：26／25609771/9.8與日本共同研制)份；HCVNAT+202321：9／25609771/28.450人份HIV-1NAT+：0／256.1混樣;2023.2.1–2023.12.31：合格血液檢測(cè)HBVNAT+308160121751/5.2HCVNAT+46／16012175,ChironProcleix2個(gè)點(diǎn)單人份，2023.06.07-2023.11.14：17利亞TMA HIV-1/HCV316人份，及個(gè)人assay;TMA, 化學(xué)發(fā)萬(wàn)；交 流光檢測(cè)；HIV-1 NAT+1/4,489,5504〔1/449.04,489,55018〕中歐HCVPCR:RocheCobasAmplicon;96人份混合HCVNAT+：6/360萬(wàn)，1/60萬(wàn)；HIVNAT+：2/360萬(wàn)，1/180萬(wàn)19HIVPCR:自己研PCR法國(guó)ChironProcleix單檢，或8人2023.07-2023.12：20TMAHIV-1/HCV；16人份,HCVNAT+：3/6141/205或RocheCobas不考慮血清學(xué)HIVNAT+：2/6141/307Nuclisens核酸提取儀坡ChironProcleixTMA HIV-1/HCVassay;單人份檢測(cè)2023.10-2023.10:HCVNAT+：4／304,715,即萬(wàn)；1/7.6個(gè)人溝通〔21〕萬(wàn)韓國(guó)ChironProcleix16人份2023.06.14-2023.12.03個(gè)人交TMAassay;HIV-1/HCV估：?jiǎn)尾色I(xiàn)漿者24599，獻(xiàn)血者15597:流〔22〕HCVNAT+：1/40196；HIVNAT1/40196；2023.01.01南非ChironProcleix單人份199923TMAHIV-1/HCVHIVNAT+:2/197091/1.0assay;HCVNAT＋:0/19709AmpliscreenHIV-1AmpliscreenHIV-1andHCV結(jié)合theOrganon我國(guó)核酸篩查技術(shù)應(yīng)用的問(wèn)題很難掌握。有關(guān)我國(guó)獻(xiàn)血者及原料漿中NAT34。3NAT檢測(cè)爭(zhēng)論的狀況單位深圳保安區(qū)中心血站廈門血液

試劑美 國(guó)BiotronicsTechHBV,HCVAmpliSensor試劑盒自行設(shè)計(jì)引

檢測(cè)方式2015000rpm離心濃縮，半自動(dòng)熒光定量PCR50人份混合，

NATHCVNAT+:1/8805(ALT390U/L)；HBVNAT+:抗-HBc陽(yáng)性中：5/495(1％)HCVNAT+:2/10000,即

文獻(xiàn)2425中心物，HCVNucliSensExtractorNASBA技ECL檢測(cè)1／5000江蘇省血液中心HCV試劑盒RNA單人份，PCR,電泳HCVNAT+:／37526上海血液美國(guó)Chiron8人份或24人份混HCVNAT+:0／103539;7中心ProcleixHIV-1/HCV光檢測(cè)HIVNAT+:0／103539;北京血液匹 基2426000gHCVNAT+:0/34373;27中心HCV/HIV-1熒光PCR檢測(cè)試劑Roche提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/34373多單位參與的國(guó)際合作深圳血液中心沈陽(yáng)血液中心

美國(guó)ChironProcleixHIV/HCVRocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV匹基HCV熒光PCR測(cè)試劑

16自動(dòng)混樣；TMA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)24人份混合，STAR2023自動(dòng)混樣;RocheMPLC自動(dòng)提取核酸；RocheCOBASAmplicor擴(kuò)增和檢測(cè)2426000gRoche提取柱，熒光PCR

HCVNAT+：2/802591個(gè)ALT254IU/ml)HIVNAT+：0/80259HCVNAT+:0/16512;HIVNAT+:0/16512;HBVNAT+:8/16512,即1/2064HCVNAT+:0/8.3

2829人溝通(深圳2023年５月)陽(yáng)血液中心，李劍平博士，20236中山中心單人份，PCR,電泳HCVNAT+:30血站及蕪77/28098(1/365)湖中心血正業(yè)HCVPCR站表4 國(guó)內(nèi)原料漿開(kāi)展NAT檢測(cè)爭(zhēng)論狀況單位試劑檢測(cè)方式NAT文獻(xiàn)中國(guó)藥品匹基HCV/HIV-12426000gHCVNAT+:0/19196;31生物制品檢定所熒光PCR核酸檢測(cè)試劑離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/19196上海萊士血制品匹 基HBV/HCV/HIV-1熒光PCR核酸檢測(cè)試劑48離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHBVNAT+:1/1401718(1/140HCVNAT+:31/1401718(1/4.532HIVNAT+:3/1250007(1/41.7中國(guó)藥品生物制品檢定所

ChironProcleixHCV/HIV-1Assay

16人份混合，TMA技HCVNAT+:1/10032; 個(gè)人溝通〔檢術(shù)；化學(xué)發(fā)光檢測(cè) HIVNAT+:0/10032 定所白堅(jiān)石20231〕我國(guó)核酸篩查技術(shù)應(yīng)用工作小結(jié)：NATNATHCV NAT+檢出率結(jié)果差異很大，從1/365〔國(guó)產(chǎn)試劑,電泳〕～1/4.0NATHCVNAT+:1/1.0～1/4.5NAT+：1/41.7；HBVNAT+：1/140〔48。必需重視核酸檢測(cè)的質(zhì)量掌握體系：留意避開(kāi)穿插污染：檢測(cè)方法：傳統(tǒng)的電泳檢測(cè)為開(kāi)放式，不適合；嚴(yán)格的核酸檢測(cè)試驗(yàn)室設(shè)置和治理。留意試劑質(zhì)量：為適應(yīng)血液混樣檢測(cè)對(duì)靈敏度的要求，一些國(guó)產(chǎn)血篩試〔如匹基〕在考察期間不錯(cuò)。但仍有待完善，表現(xiàn)在：波動(dòng)??；國(guó)產(chǎn)試劑批間差異問(wèn)題；特異性問(wèn)題。因此存在假陰性問(wèn)題。國(guó)產(chǎn)試劑尚在起步階段，尚不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，沒(méi)有配套軟件。標(biāo)本留樣和處理：也是核酸檢測(cè)質(zhì)量掌握體系中的重要環(huán)節(jié)，否則在檢NAT血液核酸篩查進(jìn)展趨勢(shì)NATNAT