動物細胞與組織培養(yǎng)

動物細胞與組織培養(yǎng)第一頁，共九十八頁，2022年，8月28日本章主要內容4.1動物細胞的特點4.2動物細胞與組織培養(yǎng)的定義與分類4.3發(fā)展簡史4.4動物細胞的體外培養(yǎng)生長特性4.5動物細胞、組織培養(yǎng)的基本技術4.6干細胞第二頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.1動物細胞的特點動物細胞屬于真核細胞，與細菌等原核細胞比進化程度高，結構、成分更復雜，功能更全面。

白血球巨噬細胞Ｔ細胞與Ｂ細胞癌細胞膠質細胞上皮細胞第三頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.1動物細胞的特點動物細胞與微生物細胞的比較（1）細胞大，無細胞壁；（2）倍增時間長，生長緩慢，易受污染；（3）需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感；（4）以聚集體形式存在；（5）原代細胞一般繁殖50代左右就退化死亡。動物細胞與植物細胞比較共同點：動植物細胞中都有細胞膜、細胞質和細胞核。區(qū)別：動物細胞中無細胞壁、葉綠體和液泡，但是有的植物細胞中無葉綠體。第四頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.1動物細胞的特點動物細胞連接的5種形式：（1）緊密連接（常見）（2）間隙連接（常見）（3）隔壁連接（無脊椎動物細胞）（4）中間連接（脊椎動物細胞）（5）橋粒連接（常見）Anchoringjunction第五頁，共九十八頁，2022年，8月28日動物細胞有三種類型的細胞連接∶◆

封閉連接

緊密連接◆

錨定連接

橋粒、粘著帶◆

通訊連接

間隙連接、化學突觸、胞間連絲細胞連接（celljunction）：

細胞間的聯系結構，是細胞質膜局部區(qū)域特化形成的，在結構上包括膜特化部分、質膜下的胞質部分及質膜外細胞間的部分。細胞連接是多細胞有機體中相鄰細胞之間通過細胞質膜相互聯系,協同作用的重要基礎。第六頁，共九十八頁，2022年，8月28日1、封閉連接（occludingjunctions)：細胞質膜細胞間隙

嵴線細胞A細胞B◆緊密連接是封閉連接的主要形式。將相鄰細胞的質膜密切的連接在一起。緊密連接的存在部位和結構特點：◆又叫不通透連接,它不僅連接相鄰的細胞,而且封閉細胞間隙,使大多數分子難以在細胞間通透。

◆這種連接方式普遍存在于腔道上皮細胞靠近管腔端的相鄰細胞膜間。

◆從結構上看,通過連接蛋白形成焊接線（嵴線），封閉相鄰細胞間的空隙。第七頁，共九十八頁，2022年，8月28日緊密連接的功能：

形成滲漏屏障，起重要的封閉作用；

◆連接作用

隔離作用，使游離端與基底面質膜上的膜蛋白行使各自不同的膜功能

支持功能第八頁，共九十八頁，2022年，8月28日2、錨定連接（Anchorjunctions)：

通過細胞骨架系統(tǒng)將細胞與相鄰細胞或細胞與基質之間連接起來。包括橋粒與半橋粒連接和粘合帶與粘合斑連接橋粒與半橋粒連接：與中間纖維相關的錨定連接。粘合帶與粘合斑連接：與肌動蛋白纖維相關的錨定連接。

◆錨定連接在組織內分布很廣泛，在上皮組織,心肌和子宮頸等組織中含量尤為豐富。◆主要靠黏著蛋白、整聯蛋白和細胞骨架體系將相鄰兩細胞或細胞與細胞外基質連接在一起。第九頁，共九十八頁，2022年，8月28日錨定連接的類型、結構與功能與中間纖維相連的錨定連接 橋粒：鉚接相鄰細胞，提供細胞內中間纖維的錨定位點，形成整體網絡，起支持和抵抗外界壓力與張力的作用。 半橋粒：半橋粒與橋粒形態(tài)類似,但功能和化學組成不同。它通過細胞質膜上的膜蛋白整合素將上皮細胞固著在基底膜上,在半橋粒中，中間纖維不是穿過而是終止于半橋粒的致密斑內。與肌動蛋白纖維相連的錨定連接

粘著帶：位于緊密連接下方,相鄰細胞間形成一個連續(xù)的帶狀 結構。間隙約15～20nm,也稱帶狀橋粒。粘著斑：細胞通過肌動蛋白纖維與細胞外基質之間的連接方式。第十頁，共九十八頁，2022年，8月28日橋粒連接第十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日◆一種特殊的細胞連接，位于特化的具有細胞間通訊作用的細胞?！艟邫C械的細胞連接作用◆

通訊連接的方式：

●間隙連接

●化學突觸

●胞間連絲3、通訊連接（communicatingjunctions)：第十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日間隙連接◆

間隙連接處相鄰細胞質膜間的間隙為2～3nm◆基本單位是連接子

●

一種跨膜蛋白

●每個連接子由6個相同或相似跨膜蛋白亞單位環(huán)繞中央形成孔徑為1.5-2nm的水性通道

●

相鄰兩細胞分別用各自的連接子相互對接形成分子間的通道，允許分子量在1000道爾頓以下的分子通過。第十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日間隙連接第十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日胞間連絲●是相鄰植物細胞壁上的一個穿過細胞壁的狹窄通道。●有管狀的內質網通過。因此，通過胞間連絲，使得相鄰細胞的細胞質膜、細胞質、內質網交融在一起?！癜g連絲直徑約30-60nm，允許1000道爾頓以下的分子滲透。第十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日●是存在于可興奮細胞間的一種連接方式，其作用是通過釋放神經遞質來傳導興奮?！袷巧窠涍f質用以傳遞電信號的通道。將電信號轉化為化學信號或將化學信號轉化為電信號的過程?！裼赏挥|前膜、突觸后膜、突觸間隙三部分組成?！裢挥|前神經元的突起末梢膨大呈球形，稱突觸小體?！裢挥|小體內有突觸小泡，內含神經遞質?；瘜W突觸第十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日細胞連接的不同方式第十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日各類連接的比較第十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.2動物細胞與組織培養(yǎng)的定義與分類1、定義動物細胞與組織培養(yǎng)（animalcellandtissueculture)

是從動物體內取出細胞或組織，模擬體內的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。2、分類

動物細胞與組織培養(yǎng)可分為細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。

第十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日

細胞培養(yǎng)(cellculture):細胞培養(yǎng)是指細胞的體外培養(yǎng),這是在無菌條件下,將機體內的組織取出,分散(機械或酶消化)成單個細胞,在模擬體內的環(huán)境中,給以營養(yǎng)物質,使細胞不斷生長、繁殖或傳代,借以觀察細胞的生長、分裂、接觸抑制以及衰老、死亡等生命現象。細胞培養(yǎng)也包括單個細胞的培養(yǎng)。器官培養(yǎng)(organculture):器官培養(yǎng)是指器官的原基(芽胚基)、整個器官或器官的一部分,在體外條件下保存(維持)或生長,并能分化和保持結構和/或功能。第二十頁，共九十八頁，2022年，8月28日

組織培養(yǎng)(tissueculture):組織培養(yǎng)是指組織在體外條件下的維持或生長。此種方法可有組織分化及保特組織的結構和/或功能的特點。這里需要說明的是,當我們做組織培養(yǎng)時,不論用什么方法和條件,組織培養(yǎng)中的主要成分仍然是細胞;細胞在生長過程中總有移動(運動)和其他變化,這樣就使得被培養(yǎng)的組織難以長期維持其原有的結構和功能。培養(yǎng)時間越長,發(fā)生變動的可能性越大。結果常使單一類型的細胞易保存下來,最終也成了細胞培養(yǎng)。所謂細胞培養(yǎng),并不意味著細胞彼此之間是獨立的。細胞在培養(yǎng)中的生命活動和體內細胞一樣,仍然是相互依存的,呈現一定組織的特征。所以組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)并無嚴格區(qū)別,兩者在一定程度上可看作是同義語。第二十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日細胞體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primaryculture):是指將機體取出的細胞或組織進行實效培養(yǎng)的過程。實效培養(yǎng)的細胞大約增殖10代左右，這樣的細胞稱為原代細胞。

傳代培養(yǎng)(subculture)：從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)的過程。

細胞系（cellline）：原代細胞經第一次傳代后，形成的細胞群體，即具有增殖能力，類型均勻的培養(yǎng)細胞，一般為有限細胞系。細胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標記的單一類型的細胞群體。

體外動物細胞在形態(tài)結構上均程度不同的與原來的細胞有所差異。第二十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日第二十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日

4.3發(fā)展簡史第1次成功地培養(yǎng)脊椎動物細胞是在1907年,美國科學家Harrison首先利用蛙淋巴液來培養(yǎng)蛙胚神經管,并觀察到神經纖維是由細胞質進行阿米巴運動所形成,解決了當時爭論不休的神經纖維起源問題。是動物細胞組織培養(yǎng)的奠基人。1912年德國科學家Carrel采用更換培養(yǎng)基和傳代的方法解決了組織塊長期存活的問題；設計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴大了組織生存空間。1943年,Earle首先培養(yǎng)C3H小鼠的結締組織并用致癌物20-甲基膽蒽處理,獲得了能回種于小鼠體內并生長肉瘤的長期培養(yǎng)的細胞系,定名為L細胞系。

5年之后,Sanfold使用預先處理的條件培養(yǎng)基(conditionmedium)成功地使L細胞系的一個單細胞在體外發(fā)展成“克隆”(clone)并繁殖成克隆株。

1951年Gey成功地用人的宮頸癌組織建立起能在體外連續(xù)培養(yǎng)的人的腫瘤細胞并定名為HeLa細胞系。這些細胞至今仍在世界各國廣為應用。L與HeLa細胞系就成為最早建成的動物與人的細胞系。第二十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日1955年Eagle研制成人工合成的培養(yǎng)基,使組織培養(yǎng)工作的勞動量大大減輕。

20世紀70年代Sato等人發(fā)展了無血清培養(yǎng),解決了血清中存在的一系列問題,使細胞培養(yǎng)技術得到長足的發(fā)展,并推動了基因工程產品及其產業(yè)的發(fā)展。

20世紀70年代以來,我國組織培養(yǎng)技術發(fā)展更快,它已不再是個別研究室所擁有的技術,而是已成為生物學和醫(yī)學研究中普遍應用的手段。近20年建立的各種細胞系已不可勝數。最近我國科學家對干細胞的研究已走在世界前列,特別是治療性克隆研究已達到世界先進水平。第二十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.4動物細胞的生長特性

1、在活體內的生長特性

，動物細胞:分化的動物細胞在功能上具有明確的分工，并具有明顯的形態(tài)學特征。

例如：肌肉細胞為紡錘形，以便于行使收縮伸展功能；神經細胞具有很長的分支，很多的纖維，以便接受和傳遞刺激；紅細胞呈園盤狀，有利于和周圍環(huán)境交換氣體和在血管內流動；上皮細胞由于它要覆蓋于表面，常常相互擠壓成不規(guī)則形狀。增殖分化第二十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日活體內的動物細胞按照分裂能力可以分為三大類：第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細胞、各類前體細胞；第二類細胞群是永久失去分裂能力的細胞，如各類高度特化的細胞；第三類是靜止細胞群，即所謂的G0細胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，則重新進入細胞分裂。如人的肝臟細胞等。

第一類和第三類細胞在適當條件下可進行離體培養(yǎng)。

第二十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日2、動物細胞的體外培養(yǎng)生長特性離體培養(yǎng)的動物細胞可分為：

（1）貼附依賴型(anchorage-dependent)（2）非貼附依賴型(anchorage-independent)（3）兼性貼附細胞第二十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）貼附型細胞簡稱為貼壁細胞，包括成纖維細胞型細胞、上皮型細胞、游走型細胞、多形型細胞。第二十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日貼附型細胞：大多數培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞。貼附:是大多數有機體細胞在體內生存和生長發(fā)育的基本存在方式。結果:

基于貼附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織，有機體的絕大多數細胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。體外培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細胞貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有貼附于固相表面才能生存的細胞。第三十頁，共九十八頁，2022年，8月28日細胞在體內、外的貼附方式：存在差異。體內：貼附是全方位,外形具有復雜的立體特征。體外：多數情況，細胞只有一個附著平面，外形一般與體內時明顯不同。貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為以下幾大類型：成纖維細胞型細胞、上皮型細胞、游走型細胞、多形型細胞。

第三十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的。來源：由中胚層間充質組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內皮。形態(tài)：似體內成纖維細胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核。生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起。成纖維細胞型細胞第三十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日成纖維細胞型細胞第三十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日名稱：僅形態(tài)上似體內，實際上不完全相同。來源：來源于外胚層、內胚層細胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤。形態(tài)：類似體內的上皮細胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動。上皮型細胞第三十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日上皮型細胞第三十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日游走型細胞特點：分散生長，細胞胞質常伸出偽足和突起，生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規(guī)則，當細胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細胞型或上皮細胞型。如淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯成片后，可呈類似多角型或成纖維細胞形態(tài)。巨噬細胞第三十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日多形型細胞特點：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。如神經元和神經膠質細胞。第三十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）非貼附型細胞（也叫懸浮型細胞）特點：細胞體外生長不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，胞體始終為球形。如血液白細胞、淋巴組織細胞、某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等。這類細胞一般呈圓形，密度較大，培養(yǎng)效率高，可進行懸浮培養(yǎng)，易于大規(guī)模生產，便于過程的控制。

（3）兼性貼壁細胞

動物細胞培養(yǎng)中，有些細胞呈現雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細胞、小鼠L929細胞等。第三十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日3、影響細胞形態(tài)學特征的主要因素：

血清成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、培養(yǎng)基成分及添加成分、溫度等。如Hela細胞原本是上皮型癌細胞，但若在過酸或過堿的條件下培養(yǎng)，可呈梭形，當酸堿度適中時又可恢復上皮型特征。

因此，細胞形態(tài)學僅是對培養(yǎng)物判斷或識別的一種參考價值指標。若想明確某一培養(yǎng)物的確切類型，必須借助于更為特異性的鑒定方法。第三十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日

4.5動物細胞、組織培養(yǎng)的基本技術1、培養(yǎng)細胞的生長特點2、培養(yǎng)細胞的生長過程3、動物細胞培養(yǎng)的基本條件4、動物細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法5、原代培養(yǎng)技術6、傳代培養(yǎng)技術7、貼壁技術8、細胞系與克隆株9、細胞的常規(guī)檢查10、細胞保存技術第四十頁，共九十八頁，2022年，8月28日1、培養(yǎng)細胞的生長特點

細胞在體外培養(yǎng)生長時其基本生物學規(guī)律與在體內時相同。但由于生活環(huán)境條件的改變，有些方面如增殖的規(guī)律等，與體內不完全相同，而有其自身的規(guī)律。

體外培養(yǎng)細胞重要的生長特點有：貼附和伸展以及接觸抑制和生長的密度限制。接觸抑制(contactinhibition)現象：除少數懸浮培養(yǎng)細胞外，大多數正常二倍體細胞的生長都需要在一定的基質（如玻璃、塑料等）上貼附，伸展后才能增殖。當細胞在基質上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個細胞與其周圍的細胞相互接觸時，細胞就停止增殖，即細胞密度不再增加，這一現象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現象。第四十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日有限細胞系和永久細胞系動物細胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)（primaryculture）。經繼代培養(yǎng)后即成為有限細胞系(finitecellline)。有限細胞系即使培養(yǎng)條件均能滿足細胞繁殖生長，它們也只能在有限的時間內生存，一般經過30~50世代后細胞將逐漸死亡。第四十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日“代”：繼代次數和存活時間的長短因細胞來源的年齡和種族不同而有差異。年齡越大繼代次數越少。人胚成纖維細胞約可以培養(yǎng)50代，而成年人的成纖維細胞則不能繼代50次，同樣是成纖維細胞，取自雞胚的成纖維細胞可繼代培養(yǎng)30代，而小鼠的只能培養(yǎng)8代。

大多數細胞系在有限的代數內以不變的形式增殖，當超過有限世代后，它們可能有兩種情況：一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細胞系或稱連續(xù)細胞系。有限細胞系轉換成永久細胞系的過度期稱為轉換期(crisis)，其轉換過程在動物細胞培養(yǎng)中稱為體外轉化(invitrotransformation)。

永久細胞系有如下特征：細胞形態(tài)變化，如細胞變小，黏附性減少，具有較高的核質比；生長速率增加，倍增時間縮短；對血清的依賴性減小；貼壁依賴性降低；細胞異倍體和非整倍體增加，細胞接種到體內后，生癌率上升。永久細胞系的建立是動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的前提。第四十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日2、培養(yǎng)細胞的生長過程

單個細胞生長過程：細胞周期動物細胞分裂周期一般為12～48小時，它不僅隨細胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細胞所需的時間也不同。此外，培養(yǎng)條件如溫度、pH、培養(yǎng)基的成分等，也會影響分裂周期的長短。細胞系的生長過程第四十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日3、動物細胞培養(yǎng)的基本條件

在體外培養(yǎng)細胞必須要能夠維持和模擬細胞在體內生存的良好環(huán)境和物質代謝過程。為此必須提供必要的營養(yǎng)、嚴格的無菌條件、適宜的pH、滲透壓、培養(yǎng)器皿、溫度和CO2等條件。顯著污染的標志是培養(yǎng)基pH迅速改變，細胞外形模糊，甚至出現飄浮的集落。

第四十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求

1）無污染環(huán)境2）溫度溫度是細胞體外生存的基本條件之一，來源不同的細胞，其最適生長溫度不盡相同。如昆蟲細胞培養(yǎng)溫度一般是25～28℃哺乳動物細胞的培養(yǎng)溫度一般是37℃。

總體上講，動物細胞忍受低溫的能力比忍受高溫的能力強。如哺乳動物細胞在45℃下只能存活1小時，但在25℃條件下仍然能慢速生長，并維持長時間不死，甚至在4℃下數小時后，再置于適宜溫度下細胞仍然可以正常生長。液氮凍存。第四十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日3）pH動物細胞培養(yǎng)適宜的pH一般在，低于6.8或高于7.6都不利于細胞生長，嚴重時會導致細胞死亡。培養(yǎng)細胞對pH的要求因培養(yǎng)時間長短有關，一般原代細胞要求較嚴格，而永久細胞系對pH具有較強的忍耐性。4）氣體環(huán)境及溶氧一般細胞在培養(yǎng)初期要求較低的溶氧水平，而在對數生長期或培養(yǎng)后期，對溶氧水平要求增加，如果供氧不足，將導致細胞缺氧而死亡。除了氧氣供應外，還應注意培養(yǎng)基的氧氣和CO2的平衡。開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。第四十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日5）滲透壓動物細胞培養(yǎng)滲透壓包括兩個方面的問題：一是培養(yǎng)基的滲透壓維持；二細胞體內的滲透壓維持。

大多數動物細胞對滲透壓的忍耐程度較強，只要培養(yǎng)基的滲透壓變化不是很劇烈，一般對培養(yǎng)物不會造成致命傷害。動物細胞滲透壓的維持一般采用平衡鹽溶液。

第四十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)要求1）天然培養(yǎng)基直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。它含有許多維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學性狀不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質。與合成培養(yǎng)基合用，能使細胞碩利增殖生長。血清中已知的成分主要有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質主要是白蛋白和球蛋白。第四十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日2）合成培養(yǎng)基

目前用于動物細胞培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基種類很多，一般均包含氨基酸、維生素、糖類、無機離子和其它輔助成分（激素、生長因子）。

盡管各種合成培養(yǎng)基給細胞培養(yǎng)帶來極大方便，但許多實驗表明，單純使用合成培養(yǎng)基細胞的貼壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用時通常仍然需要加入一定量的動物血清，常用的動物血清有小牛血清、雞血清等。常用的人工培養(yǎng)基MEM，DMEM，RPMI-1640第五十頁，共九十八頁，2022年，8月28日3）無血清培養(yǎng)基

動物血清成分復雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對細胞生長很有效，但后期對培養(yǎng)產物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在基礎培養(yǎng)基中加入細胞生長有效因子，激素等。第五十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日1、平衡鹽溶液（BSS）2、消化液：胰蛋白酶液、Na2-

EDTA液、膠原蛋白酶液3、pH調整液：NaHCO3溶液、10%醋酸溶液、HEPEs液4、抗菌素液：青霉素、鏈霉素（雙抗）液、卡那霉素液、制霉菌素液5、肝素抗凝劑6、200mmol/L谷氨酰胺4)細胞培養(yǎng)溶液第五十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日（3）培養(yǎng)工具

根據不同性質的培養(yǎng)可采用不同的培養(yǎng)器皿:固體單層培養(yǎng)可生長在塑料或玻璃瓶壁上,半固體培養(yǎng)可采用膠原或瓊脂等凝膠培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)則可用培養(yǎng)基直接培養(yǎng)。我們現在通常使用優(yōu)質中性玻璃制成的長方形玻璃培養(yǎng)瓶,規(guī)格有100mL、25mL和15mL等。有時還用扁圓形的卡氏瓶。它們的優(yōu)點是可以清洗、消毒、反復使用。細胞培養(yǎng)所用的器皿必須干凈,器械的清洗是十分重要的,它直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。

第五十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）懸滴培養(yǎng)法（2）旋轉管培養(yǎng)法（3）灌注小室培養(yǎng)法（4）卡氏瓶培養(yǎng)法（5）培養(yǎng)板培養(yǎng)法4、動物細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法第五十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）懸滴培養(yǎng)法(dropculture)——最簡單、最原始的培養(yǎng)法

懸滴培養(yǎng)法缺點：細胞生長空間狹小氣體不足，不能持續(xù)長時間生長培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基凹玻片折光，不便于觀察。第五十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）旋轉管培養(yǎng)法(rotatetubeculture)①組織塊或細胞可交替地接觸營養(yǎng)液和空氣，利于細胞生長；②培養(yǎng)管緩慢轉動，使整個管內壁全部長滿細胞，提高了細胞產量，適于較大量的組織培養(yǎng)和各種長期傳代細胞①組織塊或細胞可交替的培養(yǎng)。缺點：不易在顯微鏡下觀察。（3）灌注小室培養(yǎng)法(dabbleboothcultivation)為大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)提供了參考原理。第五十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日（4）卡氏瓶培養(yǎng)法卡氏瓶(carlsberg'sflask)（如下圖）：①將組織塊剪碎，BSS漂洗。②轉移到另一只培養(yǎng)皿，在解剖顯微鏡下去掉不需要的組織如脂肪、壞死組織等。將組織塊切成1mm3小塊。③用預先潤濕的滴管轉移到消毒離心管，靜置使組織小塊下沉，吸去上清。以新鮮BSS漂洗。重復2~3次。第五十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日④轉移到培養(yǎng)瓶（每個25ml的培養(yǎng)瓶可放置20~30塊組織小塊），吸去液體。加入1ml生長培養(yǎng)液，輕斜擺動培養(yǎng)皿，使組織小塊均勻分布。蓋好瓶蓋，36.5℃培養(yǎng)18~24h。⑤待組織塊粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培養(yǎng)液；然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)3~5周，細胞不斷增長，肉眼或低倍鏡下觀察可見圍繞組織周圍生長猶如日暈，稱“生長暈”。⑥取出中央組織塊，用預先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶。重復④~⑥操作。⑦在原生長暈培養(yǎng)瓶內換入新鮮培養(yǎng)液。待生長暈細胞擴展至約50%培養(yǎng)瓶底表面時，進行細胞培養(yǎng)。第五十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日5、原代培養(yǎng)技術一般經過組織獲得、組織消化、接種、培養(yǎng)、傳代等過程。動物細胞培養(yǎng)的基本步驟包括：先對動物體的器官組織進行切割、酶解消化，分離出單個細胞，再將單個細胞轉入含有葡萄糖、氨基酸和無機鹽的動物細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)液中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育培養(yǎng)，在將原代細胞傳代，擴大進行繼代培養(yǎng)。

第五十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）組織塊培養(yǎng)步驟如下：1、培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺內，紫外線消毒，做好洗手等準備工作.2、點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等。3、取材：第六十頁，共九十八頁，2022年，8月28日第六十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）組織消化培養(yǎng)第六十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日6、傳代培養(yǎng)技術傳代的理想時期：對數生長期，細胞80~90%或剛剛全部匯合。方法：①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶與EDTA混合液，蓋滿瓶底，作用2~5min；②檢查：如細胞間隙變大，細胞質回縮，則終止消化。③終止消化：吸出消化液；加入Hanks液，輕輕轉動，洗去殘留的消化液。如單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。③細胞計數：用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落，制成懸液，計數并記錄其濃度；④重新稀釋接種培養(yǎng)。第六十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日根據細胞特點，掌握細胞消化時間和選擇消化方法。第六十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日7、貼壁技術貼壁培養(yǎng)的材料與系統(tǒng)（1）主要材料：玻璃塑料金屬微載體（2）系統(tǒng)：微載體培養(yǎng)系統(tǒng)多孔載體培養(yǎng)系統(tǒng)中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)第六十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日

微載體培養(yǎng)法(microcarrierculture)載體：DEAE-交聯葡聚糖微粒、DEAE-纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無機玻璃基質微載體等。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞步驟：1、選擇合適的微載體類型——獲得最大量的細胞，以微載體能全部懸浮在培養(yǎng)液內為最好。2、浸泡水化及消毒 用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液浸泡3h以上。3、接種（根據細胞類型決定接種濃度）4、培養(yǎng)觀察與細胞計數5、消化6、分離細胞或傳代培養(yǎng)第六十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日多孔載體培養(yǎng)(porositycarrierculture)優(yōu)點：增加細胞固定化穩(wěn)定性，比表面積大，保證細胞充分的生長空間，細胞生長在載體內部，免受機械損傷。多孔載體被證明是用于大規(guī)模高密度細胞培養(yǎng)的優(yōu)秀細胞生長支持物，具有逐步取代傳統(tǒng)的實心微載體的趨勢。中空纖維細胞培養(yǎng)法(hollowfibercellculture)

模擬細胞在體內生長的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細血管”——中空纖維來供給細胞生長的營養(yǎng)等條件。細胞向三維空間生長繁殖，形成類似組織的多層細胞群體，細胞密度可達109個/ml。適用于細胞代謝產物和分泌物的生產。第六十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日8、細胞系與細胞株（celllineandclone）（1）細胞系的建立

原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細胞類型多而復雜，培養(yǎng)初期，生長的細胞類型多種多樣隨培養(yǎng)時間延長：一些細胞退化、死亡；另一些細胞適應環(huán)境而生長繁殖培養(yǎng)物逐步變均勻。傳代培養(yǎng)意義：不僅在于維持細胞不斷地生長，而且使培養(yǎng)物逐步演變?yōu)榫哂性鲋衬芰?、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細胞，即細胞系。細胞系：指從原代培養(yǎng)物經傳代培養(yǎng)后得來的一群特征專一、類型均勻的細胞，可以長期連續(xù)傳代。限定細胞系（有限細胞系）：壽命有限，一般為20~80代。連續(xù)培養(yǎng)細胞系（無限細胞系）：細胞發(fā)生轉化，可連續(xù)培養(yǎng)和生長，壽命變?yōu)椤盁o限”。第六十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）細胞株（克隆株） 分離單一細胞并使其繁殖形成的細胞群稱為細胞株。單個細胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養(yǎng)措施。適應和同化過程：在細胞接種到新培養(yǎng)液的初期，細胞既從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)，也要向培養(yǎng)液排出一定物質，其結果使得培養(yǎng)液更易被吸收和利用。

適應培養(yǎng)液:制備：選擇生長狀態(tài)良好的對數生長期細胞，無死細胞和碎片，所用細胞的種類應與要克隆的細胞相同。吸出培養(yǎng)液，用G6濾器過濾貯于冰箱中備用。 制備適應性培養(yǎng)基時注意：選用成分齊全的合成培養(yǎng)基，可不加抗生素。第六十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日細胞株的制備方法（3種）：（1）集落形成分離法平皿中接種稀釋細胞細胞貼壁繁殖成許多小群選擇一個最好的細胞群做標記機械法刮除所有其他細胞群培養(yǎng)保留下來的細胞群.克隆成功的關鍵：①接種細胞數量要合適、細胞要分散得好。太多則使細胞操作不便，以每個平皿50~100個細胞為宜。②選擇細胞克隆時，應逐日觀察，能證明被選留的細胞群確系來自于單個細胞。刮除和洗滌一定要徹底。第七十頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）瓊脂分離法（agarSeparation）瓊脂培養(yǎng)基的制備：

選擇質量好的瓊脂，用三蒸水配成3%的溶液，分裝，滅菌。培養(yǎng)方法：向瓊脂平皿中接種稀釋細胞懸液（適應培養(yǎng)基），培養(yǎng)后，標記出保留細胞，在顯微鏡下切下保留細胞處瓊脂小塊，在BSS中輕輕漂洗后，用適應培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第七十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日（3）多孔塑料板分離法（foamedplasticsSeparation）

將1ml含有7~8個細胞的懸液接種到多孔無毒塑料板中，每一塊板上有數十個圓形小穴。選擇僅有單個細胞的小孔觀察，待單細胞繁殖成克隆充滿小孔后，用胰酶消化分離細胞，轉移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。第七十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日9、細胞的常規(guī)檢查（corpuscularroutineexamination）檢查內容：細胞的生長狀態(tài)、培養(yǎng)液pH、污染、細胞活力。細胞生長 潛伏期：不同組織和細胞潛伏期不同。 胚胎組織——次日可見生長，1周內即連接成片。 老年組織、癌組織——潛伏期長。⑴游離期 細胞呈懸浮狀態(tài)。細胞質回縮，胞體呈圓形。⑵吸附期：與細胞種類、培養(yǎng)環(huán)境有關。大多數在24h內貼壁。細胞機能狀態(tài)不良或瀕死細胞不貼壁。培養(yǎng)基偏酸或偏堿、污染、膠基有毒、培養(yǎng)瓶洗刷不潔等均不利于細胞貼壁。支持物表面帶正電荷利于貼壁。第七十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日⑶繁殖期（idiophase）細胞由圓形變成延展細胞，進而過渡成極性細胞；繼之出現細胞分裂，細胞數目不斷增多；同時有一定的移動現象。⑷退化期（catagen）

細胞長滿瓶壁后，如不及時做再培養(yǎng)，由于營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，細胞變得粗糙（輪廓分明、胞內顆粒狀物堆積），嚴重時甚至從瓶壁脫落。第七十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日細胞形態(tài)（cellularshape）

生長良好細胞：倒置顯微鏡下觀察透明度大，輪廓不清。

機能不良細胞：輪廓鮮明，胞質中常出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物；細胞形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點；細胞間隙加大。培養(yǎng)液pH正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。隨細胞生長時間延長，CO2積累增多，超出緩沖范圍后酸化變黃，須及時更換。第七十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日

微生物污染(microbialcontamination)常見來源：培養(yǎng)液、培養(yǎng)塞、血清、操作時空氣污染。常見病菌：霉菌、細菌、支原體。⑴霉菌：培養(yǎng)基中出現相應的菌落。⑵細菌：培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細菌；如懷疑污染而培養(yǎng)液無明顯改變時，可將培養(yǎng)物進行細菌培養(yǎng)以驗證。⑶支原體污染：經常發(fā)生而難以發(fā)現。污染后的細胞仍能生存，甚至無明顯變化；有時可發(fā)生不同程度的病理改變。預防方法：嚴格遵守無菌操作。并針對不同污染采取相應措施。第七十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日細胞活性(cytoactive)原理：細胞對色素的吸附性方法：常用的是染色排除法，即死細胞著色法⑴臺盼藍染色：0.4g臺盼藍，溶于100mlHanks液，調pH至7.0~7.2。按細胞懸液：染液=9：1比例混合，4min后計數。注意時間過長，活細胞亦可受損而著色。⑵苯胺黑染色：0.05%苯胺黑（溶于Hanks液）同上比例染色，稍放置后鏡檢。注意苯胺黑溶解性較差，用前應先過濾。⑶藻紅B染色：0.02%藻紅B（溶于Hanks液）染色，2h內鏡檢。注意藻紅B易同蛋白質結合，須把血清洗凈。另：活細胞著色法：結晶紫染色：0.1%結晶紫（溶于Hanks液）染色，混合后立即鏡檢。第七十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日10、細胞保存技術（1）細胞的凍存細胞系和細胞株的保存：超低溫冰箱、液氮罐冷凍保護劑的作用：結合細胞中水分子，降溫時減少細胞內冰晶分子的形成，以免對細胞造成傷害。常用冷凍保護劑：DMSO、甘油。（2）細胞的復蘇：慢凍快融，迅速投入37℃水浴中。第七十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.6干細胞4.6.1定義

干細胞（StemCell)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的未分化細胞群體，即這些細胞可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，從而構成機體各種復雜的組織器官。

第七十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日干細胞發(fā)展史1878：出現第一篇哺乳類的體外受精卵報導。1959：完成第一例兔子的體外受精卵。1960：展開畸胚瘤的研究。1968：愛得華（R.G.Edwards）和貝敏思特（B.D.Bavister）進行人類的體外受精研究。第八十頁，共九十八頁，2022年，8月28日從1970年MartinEvans首次從小鼠胚囊中分離出小鼠胚胎干細胞，到原被誤認為功能單一的干細胞后被證實具有自我復制能力，且可分化為人體206種組織器官的原始細胞。1978：世界第一個試管寶寶路易絲．布朗（LouiseBrown）在英國誕生。1980：肯蒂絲．瑞得（CandaceReed）成為澳洲的第一個試管寶寶。1981：艾凡斯等（M.J.Evans,etal.）體外培養(yǎng)老鼠的胚胎干細胞；伊莉莎白．卡爾（ElizabethCarr）成為美國的第一個試管寶寶。1984～1988：安德魯等（P.W.Andrews,etal.）在體外培養(yǎng)人類畸胚瘤細胞。1989：佩拉等（M.F.Pera,etal.）制造人類畸胚瘤細胞株。1994：首次使用人類人工受精的囊胚進行干細胞的研究。1995～1996：從恒河猴取得胚胎干細胞，并在體外培養(yǎng)分化成三種胚層。第八十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日1998：詹姆士．湯姆生（JamesThomson）從人類體外受精卵取得胚胎干細胞，并能穩(wěn)定地在體外培養(yǎng)；吉爾哈特（J.Gearhart）從妊娠中止的胎兒內取出其卵巢或睪丸組織，得到一種具有干細胞特性的原始生殖細胞，稱為人類生殖干細胞。1999：《科學》（Science）雜志公布干細胞為世界十大科技進展榜首。從小鼠肌肉組織取得的成體干細胞可以「橫向分化為血液細胞」。此后，科學家相繼證實成體干細胞具有可塑性。2000：美國61名諾貝爾獎得主及其它科學家聯名要求美國政府對干細胞研究給予全面支持，同年美國總統(tǒng)柯林頓宣布美國政府準許用政府經費進行人體胚胎干細胞研究。2001：胚胎干細胞株可以培養(yǎng)出神經、胰島等更多種類的細胞。美國總統(tǒng)布什宣布聯邦政府將有限資助胚胎干細胞研究。2002：《自然》（Nature）雜志評選「干細胞的爭議」為2002年科學界年度重大新聞。第八十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.6.2干細胞的特性4.6.2.1形態(tài)和生化特征1、干細胞形態(tài)上通常呈圓形或橢圓形、體積小、核質比例較大。2、干細胞具有較高的端粒酶活性，因此具有較強的增殖能力。4.6.2.2干細胞增殖特性1、緩慢性：有利于干細胞對特定的外界信號做出反應，以決定進行增殖還是進入特定分化程序。另外，還可以減少基因發(fā)生突變的可能性，使干細胞有足夠時間發(fā)現和糾正復制錯誤，從而避免產生自身突變。2、自穩(wěn)性：即干細胞會自我更新維持自身數目的恒定。這是干細胞區(qū)別于腫瘤細胞的一個本質特征。第八十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日干細胞的形態(tài)胚胎干細胞克隆第八十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.6.2.3干細胞巢及其微環(huán)境

干細胞在機體內的居所稱為干細胞巢。在干細胞巢中所有控制干細胞增殖與分化的外部信號構成了干細胞生存的微環(huán)境。如：分泌因子、受體介導的細胞間的相互作用、整和素和胞間基質等。第八十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日

正常胚胎發(fā)育過程是按嚴格的時空程序進行一系列細胞與細胞之間、核質之間相互作用的結果。從全能配套干細胞或組織譜系干細胞最終分化為體細胞，主要取決于哪些基因被激活和在什么時間與位點被激活。細胞環(huán)境中的各種因子的類型和濃度則是基因選擇性激活的重要因素。

細胞分化是部分基因選擇性地被激活或差異表達、從而控制專一性蛋白的合成和排布的結果。對細胞分化來說，最重要的是多個基因表達過程在數