生物化學(xué)-第4講dna復(fù)制

鏈

DNA的化學(xué)合①鏈增 封3’→5’3’→5’不需要模

縮④⑤1λmax= U

核酸的紫外吸收光溫CTDNA:A260/A280=1.8RNA:A260/A280=

增色效應(yīng)：核酸變性減色效應(yīng)：核酸復(fù)性，消光系2上節(jié)回 核酸的分離純CsCl超速離 電泳分電泳可分離不同長度 PAGE和瓊脂糖凝膠3上節(jié)回 “序列–片段長度–遷移率待測DNA作模需要DNA聚合酶以四種dNTP為原在引物作用下合 4例如

核酸內(nèi)DNA連接5 蛋白核酸的核酸研究的化學(xué)RNA轉(zhuǎn)錄與加蛋白質(zhì)核苷酸分解代謝及生物6核酸生物第四DNA課后閱讀第30第2Lehninger第257E.圖8一、 的基本原半保原

Meselson-Stahl實(shí) 9從起點(diǎn)開始雙叉

利用denaturation發(fā)現(xiàn)存 原點(diǎn)單 ：一 叉單向移動。如某些環(huán)狀DNA相 ：從兩個(gè)起點(diǎn)起始，兩 叉各以一條為模板相 。如 半不連 (5’→3’方向叉移動片段(1968年

滯后

前導(dǎo) DNA的前導(dǎo)鏈以5’→3’方向連續(xù)滯后鏈的合成不連續(xù)，且相反 叉前進(jìn)方向原核生 片段約1000nt；真核生物約200nt二、 的化學(xué)反DNA聚合ArthurDNA聚合酶

模板(dNMP)n+ (dNMP)n+1+利用dNTP為底物，需要金屬離子以DNA為模板DNA聚合酶可以甄別正確底配配才能被酶催化進(jìn)行聚合反應(yīng)，該校對作用保證了入核苷酸的錯誤率僅為10-5 發(fā)現(xiàn)錯后只作用于DNA3’末端的錯配 切苷酸，不作用于雙鏈DNA正常生長的鏈，只有出現(xiàn)錯配時(shí)，生長鏈的3’末端才會落入3’→5’外切，使錯配堿基立即被清除 聚合酶鏈反應(yīng)PCR(polymerasechainreaction)可實(shí)現(xiàn)體外快速 或DNA序列。1985年，K.Mullis提沒 叉怎么辦？將DNA變性，使雙鏈分開Kary(1944~至今

所需材引物、金屬離子(Mg2+) PCR(polymerasechain三、原核 的分子機(jī)原核生物DNA37℃時(shí)的催化速率：1000dNTP/min/每分多聚合酶活性（催化鏈沿5’→3’方向延長）功3’→5’核酸外切酶活性（具有核對功能）能5’→3’核酸外切酶活性(作用于雙鏈）酶從3’端使DNA鏈發(fā)生焦磷酸解（逆反應(yīng)焦磷酸鹽與dNTP之間的焦磷酸基DNA聚合酶Ⅰ催化的聚合反應(yīng)合成速度是細(xì)胞內(nèi) 速度的持續(xù)合成能力低（細(xì)胞內(nèi) 并不頻繁中斷 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ 年5’→3’合成，引物為小缺口的雙鏈具3’→5’外切酶活酶活性只有聚合酶Ⅰ的DNA聚合酶 缺陷的變異株，細(xì)胞生速度正推斷：DNA聚合酶Ⅰ和聚合酶II均不是真正 DNA聚合酶III(1971年具有5’→3’聚合和3’→5’活性高達(dá)大腸桿菌 的主導(dǎo)聚合

DNA聚合酶IIIDNA

DNA裝配 滑動DNA，同源六聚體，是體央孔洞直徑約3.5nm能， 的起大腸桿 原點(diǎn)

ssDNA結(jié)合 13bp保守序

9bp保守序列，DnaA

解旋 在完在完合成雙+

四聚體形式，單 生 生 張單鏈結(jié)解鏈酶DnaB六聚DnaC

起始復(fù)3×13bp序列變RNA疑問：聚合酶只能延長已有的DNA如何開始？滯后鏈上片段的合成如 引物合成方向：5’→3’，與DNA催化引物合成的酶：引物合成 連接酶： 的延①②③前導(dǎo)前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成同時(shí)前導(dǎo) RNA10－60

引物合(RNA聚合酶DNA聚合酶持續(xù)合

10個(gè)核苷5’-3’合片5’-3’外切5’-3’聚合

體不斷成RNA引DNA聚合酶DNA聚合I引物間 細(xì)菌：1000-

DNA連接真核細(xì)胞：100-

DNA連接酶(DNAligase,基團(tuán)和3OH共價(jià)連接生成腺苷的原核 機(jī)去除引連接1800 是一個(gè)高保真系統(tǒng)(E.coli錯配率:10-9-10-10)－DNA聚合酶具有選擇正確堿基的能－DNA聚合酶具有自我核對功（鏈延長前識別末端堿基－消除RNA大，為保證忠實(shí)性，必須刪除任何不確連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的原核 機(jī)①連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的原核 機(jī)②連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的原核 機(jī)③連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的原核 機(jī)④連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的原核 機(jī)⑤4. 的終 制叉，釋四、真核 的分子機(jī)組更DNA與組蛋白速度比原核生物細(xì)菌 叉移動：50哺乳類動物DNA：1-3人類DNA每30-300Kb有一 起始位每條染色質(zhì)上有多 起始子小，40- 時(shí)間基本相完成前，各起點(diǎn)不再開始新原核生物可在原點(diǎn)連續(xù)發(fā) （多 叉真核生物DNA聚合真核生物DNA聚合酶的特性比性αβγδε4122-細(xì)胞內(nèi)分核核線粒核核功DNA引合損傷修線粒修3’→5’無無有有有5’→3’無無無無無DNA聚合酶共同具有的性質(zhì)：需模板，引物激活，dNTP為底物，鏈延伸方向?yàn)閰^(qū)別：真核生物DNA聚合酶可以沒有外切 DNA聚合酶α有引物合成酶活性，即起始前導(dǎo)鏈和 DNADNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在損傷修復(fù)中起DNA聚合酶γ是線粒體DNA的合成酶 DNA聚合酶δ有3’→5’外切酶 DNA聚合酶ε與滯后鏈合成有關(guān)，是具有校對功能DNA聚合酶ε與滯后鏈合成有關(guān)，是具有校對功能真核生物DNA 機(jī)負(fù)責(zé)延伸前導(dǎo)

DNA聚合酶DNA聚合酶

前導(dǎo) 叉

復(fù)合酶負(fù)責(zé)合成滯后 DNA聚合酶δ或鏈 片

DNA聚合酶去除RNA

在連接

RNA降解

FEN1蛋白（5’→3’外切酶活 端粒結(jié)DNA 切掉的引物端逐步縮子代鏈 3端逐步縮

子鏈DNA短于 人的端粒端 端

富含富含成串的短的重復(fù)序端粒結(jié)構(gòu)的縮短可通過端粒酶外加重復(fù)單位補(bǔ)足端粒酶：逆轉(zhuǎn)錄酶，分子內(nèi)含一條約有150個(gè)堿基RNA鏈和1.5個(gè)拷貝的端粒重復(fù)單合成端粒