生物化學-第4講dna復制

鏈

DNA的化學合①鏈增 封3’→5’3’→5’不需要模

縮④⑤1λmax= U

核酸的紫外吸收光溫CTDNA:A260/A280=1.8RNA:A260/A280=

增色效應：核酸變性減色效應：核酸復性，消光系2上節(jié)回 核酸的分離純CsCl超速離 電泳分電泳可分離不同長度 PAGE和瓊脂糖凝膠3上節(jié)回 “序列–片段長度–遷移率待測DNA作模需要DNA聚合酶以四種dNTP為原在引物作用下合 4例如

核酸內(nèi)DNA連接5 蛋白核酸的核酸研究的化學RNA轉錄與加蛋白質核苷酸分解代謝及生物6核酸生物第四DNA課后閱讀第30第2Lehninger第257E.圖8一、 的基本原半保原

Meselson-Stahl實 9從起點開始雙叉

利用denaturation發(fā)現(xiàn)存 原點單 ：一 叉單向移動。如某些環(huán)狀DNA相 ：從兩個起點起始，兩 叉各以一條為模板相 。如 半不連 (5’→3’方向叉移動片段(1968年

滯后

前導 DNA的前導鏈以5’→3’方向連續(xù)滯后鏈的合成不連續(xù)，且相反 叉前進方向原核生 片段約1000nt；真核生物約200nt二、 的化學反DNA聚合ArthurDNA聚合酶

模板(dNMP)n+ (dNMP)n+1+利用dNTP為底物，需要金屬離子以DNA為模板DNA聚合酶可以甄別正確底配配才能被酶催化進行聚合反應，該校對作用保證了入核苷酸的錯誤率僅為10-5 發(fā)現(xiàn)錯后只作用于DNA3’末端的錯配 切苷酸，不作用于雙鏈DNA正常生長的鏈，只有出現(xiàn)錯配時，生長鏈的3’末端才會落入3’→5’外切，使錯配堿基立即被清除 聚合酶鏈反應PCR(polymerasechainreaction)可實現(xiàn)體外快速 或DNA序列。1985年，K.Mullis提沒 叉怎么辦？將DNA變性，使雙鏈分開Kary(1944~至今

所需材引物、金屬離子(Mg2+) PCR(polymerasechain三、原核 的分子機原核生物DNA37℃時的催化速率：1000dNTP/min/每分多聚合酶活性（催化鏈沿5’→3’方向延長）功3’→5’核酸外切酶活性（具有核對功能）能5’→3’核酸外切酶活性(作用于雙鏈）酶從3’端使DNA鏈發(fā)生焦磷酸解（逆反應焦磷酸鹽與dNTP之間的焦磷酸基DNA聚合酶Ⅰ催化的聚合反應合成速度是細胞內(nèi) 速度的持續(xù)合成能力低（細胞內(nèi) 并不頻繁中斷 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ 年5’→3’合成，引物為小缺口的雙鏈具3’→5’外切酶活酶活性只有聚合酶Ⅰ的DNA聚合酶 缺陷的變異株，細胞生速度正推斷：DNA聚合酶Ⅰ和聚合酶II均不是真正 DNA聚合酶III(1971年具有5’→3’聚合和3’→5’活性高達大腸桿菌 的主導聚合

DNA聚合酶IIIDNA

DNA裝配 滑動DNA，同源六聚體，是體央孔洞直徑約3.5nm能， 的起大腸桿 原點

ssDNA結合 13bp保守序

9bp保守序列，DnaA

解旋 在完在完合成雙+

四聚體形式，單 生 生 張單鏈結解鏈酶DnaB六聚DnaC

起始復3×13bp序列變RNA疑問：聚合酶只能延長已有的DNA如何開始？滯后鏈上片段的合成如 引物合成方向：5’→3’，與DNA催化引物合成的酶：引物合成 連接酶： 的延①②③前導前導鏈和滯后鏈的合成同時前導 RNA10－60

引物合(RNA聚合酶DNA聚合酶持續(xù)合

10個核苷5’-3’合片5’-3’外切5’-3’聚合

體不斷成RNA引DNA聚合酶DNA聚合I引物間 細菌：1000-

DNA連接真核細胞：100-

DNA連接酶(DNAligase,基團和3OH共價連接生成腺苷的原核 機去除引連接1800 是一個高保真系統(tǒng)(E.coli錯配率:10-9-10-10)－DNA聚合酶具有選擇正確堿基的能－DNA聚合酶具有自我核對功（鏈延長前識別末端堿基－消除RNA大，為保證忠實性，必須刪除任何不確連續(xù)運轉的原核 機①連續(xù)運轉的原核 機②連續(xù)運轉的原核 機③連續(xù)運轉的原核 機④連續(xù)運轉的原核 機⑤4. 的終 制叉，釋四、真核 的分子機組更DNA與組蛋白速度比原核生物細菌 叉移動：50哺乳類動物DNA：1-3人類DNA每30-300Kb有一 起始位每條染色質上有多 起始子小，40- 時間基本相完成前，各起點不再開始新原核生物可在原點連續(xù)發(fā) （多 叉真核生物DNA聚合真核生物DNA聚合酶的特性比性αβγδε4122-細胞內(nèi)分核核線粒核核功DNA引合損傷修線粒修3’→5’無無有有有5’→3’無無無無無DNA聚合酶共同具有的性質：需模板，引物激活，dNTP為底物，鏈延伸方向為區(qū)別：真核生物DNA聚合酶可以沒有外切 DNA聚合酶α有引物合成酶活性，即起始前導鏈和 DNADNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在損傷修復中起DNA聚合酶γ是線粒體DNA的合成酶 DNA聚合酶δ有3’→5’外切酶 DNA聚合酶ε與滯后鏈合成有關，是具有校對功能DNA聚合酶ε與滯后鏈合成有關，是具有校對功能真核生物DNA 機負責延伸前導

DNA聚合酶DNA聚合酶

前導 叉

復合酶負責合成滯后 DNA聚合酶δ或鏈 片

DNA聚合酶去除RNA

在連接

RNA降解

FEN1蛋白（5’→3’外切酶活 端粒結DNA 切掉的引物端逐步縮子代鏈 3端逐步縮

子鏈DNA短于 人的端粒端 端

富含富含成串的短的重復序端粒結構的縮短可通過端粒酶外加重復單位補足端粒酶：逆轉錄酶，分子內(nèi)含一條約有150個堿基RNA鏈和1.5個拷貝的端粒重復單合成端粒