第三篇 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作方法

第三篇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是當(dāng)代生命科學(xué)研究的重要組成部分，從巴甫洛夫的條件反射發(fā)現(xiàn)到通過電刺激大腦揭示動(dòng)物應(yīng)答系統(tǒng)的中樞定位理論建立；以及當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域建立的各種動(dòng)物病理模型等等無不體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要性。在生命科學(xué)、人類醫(yī)藥和健康研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生命活動(dòng)中的生理和病理過程，與人類或異種動(dòng)物都有很多相似之處，并可互相參照，一種動(dòng)物的生活過程可以成為另一種動(dòng)物或者人類的參照物。對(duì)一些難以在人身上進(jìn)行的工作，及一些數(shù)量很少的珍稀動(dòng)物，或一些因體形龐大、不易實(shí)施操作的動(dòng)物種類，采用取材容易、操作簡(jiǎn)便的另一種動(dòng)物來代替人類或原來的目標(biāo)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，這就是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。為了保證這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更科學(xué)、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，可以用各種方法把一些需要研究的生理或病理活動(dòng)相對(duì)穩(wěn)定地顯現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上，供實(shí)驗(yàn)研究之用。這些標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物就稱之為模式動(dòng)物。無論是從事生命科學(xué)研究還是從事環(huán)境生物科學(xué)研究者，只有對(duì)常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)特征、來源、主要用途以及實(shí)驗(yàn)操作方法有了基本了解，才能正確地選擇與使用動(dòng)物，才能獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)。尤其是隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的不斷深入和發(fā)展，不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類和質(zhì)量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化管理和相應(yīng)的法制條例，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用人也提出了同樣嚴(yán)格的操作要求和行為準(zhǔn)則。所謂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(experimemtalanimals)，一般是指“所有脫離自然環(huán)境而用于教學(xué)、研究和試驗(yàn)的動(dòng)物”。但目前不同分支學(xué)科的教科書或操作手冊(cè)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劃定有很大差異，有的局限于哺乳動(dòng)物的嚙齒類、貓、犬和靈長(zhǎng)類動(dòng)物；有的則擴(kuò)展到魚類、兩棲類、爬行類和鳥類。本教材則將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物定義范圍擴(kuò)展列低等的無脊椎動(dòng)物(只要它們的來源或遺傳背景清楚并已脫離野生環(huán)境)，這是基于下述2個(gè)理由：(1)生命科學(xué)(及環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué))研究所使用的動(dòng)物并不局限于哺乳動(dòng)物。(2)國(guó)際上已有許多發(fā)達(dá)國(guó)家的科學(xué)界和政府部門制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例”中往往強(qiáng)調(diào)“科學(xué)研究盡可能使用低等動(dòng)物(如原生動(dòng)物、蚯蚓、昆蟲等)而不用高等動(dòng)物”。知道了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的定義及其在生命科學(xué)的教學(xué)科研中的重要與必需，那么作為生命科學(xué)院的學(xué)生則有必要在理解優(yōu)化動(dòng)物、人道地對(duì)待動(dòng)物和有效研究的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)和掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本操作方法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本知識(shí)第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按遺傳學(xué)控制分類近交系（InbredStrain）近交系的基本概念理論上把近交程度相當(dāng)于連續(xù)全同胞兄妹交配20代以上，近交系數(shù)達(dá)98.6%以上，群體基因達(dá)到高度純合和穩(wěn)定的動(dòng)物全體稱之為近交系。近交（inbreeding）是指任何血緣關(guān)系相近的個(gè)體間進(jìn)行的配偶，屬于基因型分離交配。它能使動(dòng)物群的基因純合而達(dá)到穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳培育過程中，常見的近交方式有：全同胞兄妹（BXSmating），父女或母子交配（回交backcross），堂兄妹交配（cousinmating）等。近交系動(dòng)物的特點(diǎn)及應(yīng)用基因位點(diǎn)純合性（homozygosity）遺傳組成的同源性（isogenicity）長(zhǎng)期遺傳穩(wěn)定性（stability）均一性（uniformity）遺傳特征的可辨別性（identifiability）遺傳組成的獨(dú)特性（individuality）國(guó)際分布性（internationaldistribution）背景資料的完整性(backgrounddata)封閉群（ClosedColony）封閉群動(dòng)物的基本概念通常把5年以上不從外部引種，只在群體內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)交配，為日常提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而進(jìn)行生產(chǎn)的群體稱之為封閉群。封閉群是一個(gè)長(zhǎng)期與外界鼓勵(lì)，雌雄個(gè)體之間能夠隨機(jī)交配的動(dòng)物群。封閉群的關(guān)鍵在于不從外部引進(jìn)任何新的基因，同時(shí)亦不讓群內(nèi)基因因近交而丟失，以保持封閉群一般遺傳性和雜合性。封閉群動(dòng)物的特點(diǎn)及應(yīng)用封閉群動(dòng)物具有雜合性，避免了近交衰退的出現(xiàn)，具有較強(qiáng)的繁殖力和生活力；封閉群動(dòng)物的遺傳組成具有很高度的雜合性；就整體而言，其遺傳特性以及其他反應(yīng)性能保持相對(duì)穩(wěn)定，但就群體內(nèi)個(gè)體而言，因其具有雜合性，所以個(gè)體間的反應(yīng)性具有差異。常用的封閉群動(dòng)物常用的封閉群動(dòng)物主要有：昆明小鼠，NIH小鼠，ICR小鼠，LACA小鼠，Wistar大鼠，SD（Sprague-Dawley）大鼠，DunkinHarleg豚鼠，青紫蘭兔，新西蘭兔等。突變系（MutantStrain）突變動(dòng)物的基本概念由于遺傳物質(zhì)的變化而使親代與子代在某個(gè)形狀上發(fā)生的變化稱為遺傳變異，這種變異一般可以通過生殖過程而傳遞給后代。而具有了突變型基因的動(dòng)物稱為突變動(dòng)物,這些突變動(dòng)物按照生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求,進(jìn)行定向培育,育成的具有突變基因的近交系稱為突變系(MutantStrain)。突變系動(dòng)物的特點(diǎn)及應(yīng)用遺傳變異具有不定向性，對(duì)突變系動(dòng)物的研究可以用來認(rèn)識(shí)生命的復(fù)雜性，解釋一些基本的生命現(xiàn)象。突變系動(dòng)物作為人類疾病的動(dòng)物模型而在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。例如糖尿病小鼠，4號(hào)染色體基因發(fā)生隱形突變（db），純合子小鼠肥胖，并伴有糖尿病，可作為糖尿病模型用于實(shí)驗(yàn)。常用的突變系動(dòng)物糖尿病小鼠； 肥胖癥大鼠（fa），第5號(hào)染色體隱性突變，純合子動(dòng)物肥胖，飲食亢進(jìn)，血清中胰島素含量高。系統(tǒng)雜交動(dòng)物（HybridAnimal）系統(tǒng)雜交動(dòng)物的基本概念兩個(gè)不同近交系雜交所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物稱系統(tǒng)雜交動(dòng)物或F1動(dòng)物（Firstfilialgeneration）。系統(tǒng)雜交動(dòng)物的特點(diǎn)及應(yīng)用雜交優(yōu)勢(shì)遺傳和表型上的一致性具有雜合的遺傳組成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（TransgenicAnimal）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的動(dòng)物。嵌合體動(dòng)物（Chimeras）嵌合體動(dòng)物是指將動(dòng)物早期胚胎進(jìn)行分后與同種或異種的胚胎細(xì)胞聚合而發(fā)育成的個(gè)體。嵌合體動(dòng)物體內(nèi)帶有兩種遺傳組成不同的細(xì)胞，從遺傳組成特征來說，是自然界前所未有的類型。廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、免疫功能、遺傳病等研究領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物控制分類微生物控制是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要內(nèi)容。在開放條件下飼養(yǎng)，未經(jīng)微生物控制的動(dòng)物，體表和體內(nèi)存在著大量的，種類繁多的微生物和寄生蟲，這給實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不良影響。另外，一些人獸共患的病原體可以在人和動(dòng)物之間交叉感染，對(duì)動(dòng)物管理人員和實(shí)驗(yàn)者的健康構(gòu)成威脅，因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微生物控制有著極為重要的意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所攜帶其他生命體的情況，目前國(guó)際上一般將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四個(gè)等級(jí)，即：無菌動(dòng)物（germfreeanimal,GF）,悉生動(dòng)物（gnotobioticanimal,GN,無特定病原體動(dòng)物（specificpathogenfreeanimal,SPF）和普通動(dòng)物（conventionalanimal,CV）。并對(duì)每個(gè)等級(jí)動(dòng)物的微生物控制程度和飼養(yǎng)環(huán)境條件進(jìn)行以下規(guī)定：表1按微生物控制程度的分類原則種類飼養(yǎng)條件控制程度無菌動(dòng)物（GF）隔離系統(tǒng)Isolationsystem以無菌技術(shù)獲得，用現(xiàn)有的方法見不出任何微生物和寄生蟲的動(dòng)物悉生動(dòng)物（GN）隔離系統(tǒng)Isolationsystem帶有明確的微生物叢，無菌條件飼育的動(dòng)物SPF動(dòng)物屏障系統(tǒng)Barriersystem不帶有指定的致病性微生物和寄生蟲的動(dòng)物普通動(dòng)物（CV）開放系統(tǒng)Opensystem微生物、寄生蟲帶有情況不明確，但不能帶有人畜共患的和致動(dòng)物烈性傳染病的病原體的動(dòng)物普通動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中將飼養(yǎng)在開放環(huán)境中,未經(jīng)積極的微生物控制,不攜帶主要人獸共患病和動(dòng)物烈性傳染病病原體的動(dòng)物稱之為普通動(dòng)物。普通動(dòng)物是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中再微生物控制上要求最低的動(dòng)物，這種動(dòng)物本身所攜帶的微生物狀況不明確，僅要求排除能感染人類的人獸共患病原體如：流行性出血熱病毒，LCM病毒，沙門氏菌，致病性皮膚真菌，弓形體和體外寄生蟲等，以及能引起動(dòng)物自身烈性傳染病的病原體：鼠痘病毒、兔出血癥病毒等。普通動(dòng)物由于自身所攜帶的微生物背景不明確，難以排除微生物和寄生蟲等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，故不適合進(jìn)行科學(xué)研究。清潔動(dòng)物清潔動(dòng)物也稱清潔級(jí)普通動(dòng)物，是指除一級(jí)動(dòng)物應(yīng)排除的病原體外，不攜帶對(duì)動(dòng)物危害大和對(duì)科學(xué)研究干擾大的病原體的動(dòng)物。一般國(guó)外科學(xué)實(shí)驗(yàn)采用SPF動(dòng)物或無菌動(dòng)物，根據(jù)我國(guó)目前的發(fā)展?fàn)顩r和具體條件，普及SPF動(dòng)物尚有一定困難。清潔級(jí)動(dòng)物作為之中過渡在我國(guó)得到廣泛應(yīng)用。清潔級(jí)動(dòng)物較普通動(dòng)物健康，在實(shí)驗(yàn)過程中可排除動(dòng)物疾病的干擾，又較SPF動(dòng)物容易達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，目前可作為一種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于一般科學(xué)實(shí)驗(yàn)。無特定病原體動(dòng)物無特定病原體動(dòng)物簡(jiǎn)稱SPF動(dòng)物，是指除一，二級(jí)動(dòng)物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF動(dòng)物來源于吳軍動(dòng)物或剖腹產(chǎn)動(dòng)物，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，體內(nèi)及環(huán)境中都不存在致病性微生物和寄生蟲，屬于健康無病動(dòng)物。SPF動(dòng)物在廣義上也屬悉生動(dòng)物范疇，但帶菌的情況不如悉生動(dòng)物明確，只知道動(dòng)物排除了哪些微生物和寄生蟲，而不知道還攜帶那些其他生命體，但能安全課可靠地排除微生物和寄生蟲對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，目前已廣泛應(yīng)用于藥物學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、傳染病學(xué)、多種診斷血清和疫苗的產(chǎn)生，以及生物制品的鑒定中。無菌動(dòng)物（Germfreeanimal,GFA）無菌動(dòng)物是指現(xiàn)有技術(shù)手段從動(dòng)物體內(nèi)外檢查不到其他生命體的動(dòng)物。無菌動(dòng)物來源于無菌的剖腹產(chǎn)，然后將仔獸轉(zhuǎn)移到絕對(duì)屏障系統(tǒng)——隔離器中，經(jīng)人工哺育或無菌動(dòng)物代乳飼育而成。其微生物控制要求是用現(xiàn)有技術(shù)手段檢測(cè)不到任何微生物和寄生蟲。悉生動(dòng)物(Gnotobioticanimal,GNA)悉生動(dòng)物又稱已知菌動(dòng)物（animalwithknownbactericlfflora）,一般是指動(dòng)物體內(nèi)所攜帶的其他生命體是已知的，并在屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)的動(dòng)物。廣義的悉生動(dòng)物包括無