研究EVATHG對機(jī)體免疫機(jī)能的影響,免疫學(xué)論文

研究EVATHG對機(jī)體免疫機(jī)能的影響,免疫學(xué)論文乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的以肝臟為主要損害器官的傳染病。全球每年約有450萬人感染HBV，約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。對于乙型肝炎的傳播流行，當(dāng)前尚無特效的治療藥物，普遍接種疫苗是控制乙型肝炎發(fā)生的有效方式方法。由于全球感染HBV的人數(shù)諸多，感染人群的分布多集中于不發(fā)達(dá)和貧窮國家，怎樣使乙肝疫苗愈加經(jīng)濟(jì)、安全、和易于推廣是重要的研究方向。轉(zhuǎn)HBsAg基因可食用疫苗苜蓿就是在該領(lǐng)域中的一項有益的探尋求索。苜蓿是一種蛋白質(zhì)含量高且品質(zhì)穩(wěn)定，被以為是最有可能生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的植物體系。苜蓿在抗病、抗蟲、固氮、品質(zhì)改進(jìn)等方面獲得了廣泛的應(yīng)用，而利用苜蓿作為植物表示出載體開發(fā)疫苗的研究也日益遭到關(guān)注。EVATHG是通過克隆乙型肝炎病毒的外膜小蛋白(S)及中蛋白(S2＆S)抗原基因，并通過基因修飾后，構(gòu)建的分別含有這兩種外源基因的高效植物表示出載體，是一種可食用的植物疫苗。苜蓿表示出的抗原已被證實能延緩和防止某些疾病的發(fā)生。但是，轉(zhuǎn)基因植物作為生物新材料，其對健康的影響一直倍受關(guān)注。1998年，蘇格蘭科學(xué)家實驗證明，幼鼠在食用轉(zhuǎn)基因土豆后，器官生長異常，體重和器官重量減輕且免疫系統(tǒng)遭受毀壞。2008年，意大利科學(xué)家研究證明MON810轉(zhuǎn)基因玉米可引起斷奶幼鼠免疫系統(tǒng)異常。轉(zhuǎn)基因苜蓿作為一種新型的植物基因重組食用植物疫苗，對于動物或人類均沒有接觸史，也沒有相關(guān)的流行病學(xué)資料，其對健康的影響在很多方面具有未知性，尤其是在對免疫系統(tǒng)功能的影響方面。本實驗以小鼠為受試生物，通過測定小鼠的體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫以及免疫器官的病理組織學(xué)等相關(guān)指標(biāo)的變化，初步研究EVATHG對機(jī)體免疫機(jī)能的影響，進(jìn)而為其研發(fā)應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。1材料與方式方法1．1試驗材料1．1．1受試物及處理EVATHG為綠色粉末，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。為新鮮的轉(zhuǎn)基因苜蓿草曬干后磨粉，過200目篩后制成。實驗以蒸餾水為溶媒配制成不同濃度的混懸液供試。1．1．2實驗動物和環(huán)境條件實驗用ICR小鼠由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號分別為SCXK(滬)2008－0016，清潔級，雌性，體重20g2g。實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14924－2001。檢測環(huán)境條件，實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2008－0106，溫度范圍20℃～24℃，相對濕度范圍40%～70%。實驗動物試驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3d。1．2方式方法1．2．1實驗分組與劑量實驗設(shè)EVATHG低、中、高劑量組及陰性對照組(蒸餾水)和野生型苜蓿組。根據(jù)黃繼漢等人介紹的方式方法算得小鼠的等效劑量大致相當(dāng)于人推薦劑量的10倍，設(shè)1．0g/kg為實驗中劑量組，在這里劑量的上、下再各設(shè)實驗低劑量組0．5g/kg和實驗高劑量組2．0g/kg，分別相當(dāng)于人推薦劑量的5倍和20倍。低、中、高三個劑量組分別給EVATHG0．5g/kg、1．0g/kg、2．0g/kg體重，陰性對照組和野生型苜蓿組則分別給予等體積的蒸餾水和野生型苜蓿(2．0g/kg)。每項免疫學(xué)指標(biāo)采用清潔級ICR小鼠50只，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只小鼠。采用灌胃方式給受試物，天天1次，灌胃容量按20ml/kg體重計，持續(xù)30d后進(jìn)行各項指標(biāo)測試。1．2．2指標(biāo)測定1．2．2．1小鼠免疫器官臟體比的測定及病理組織學(xué)檢查實驗期末處死動物，摘取中樞免疫器官胸腺及周圍免疫器官脾臟，分別稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重比值，并用福爾馬林固定，常規(guī)制片，H．E染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。1．2．2．2ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗于試驗期末，小鼠無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕撕碎，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，Hanks液洗滌3次，臺盼蘭染色計數(shù)，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3106個/ml。將細(xì)胞懸液分兩孔參加培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加60lConA液(相當(dāng)于6g/ml)，另一孔作為對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0．7ml，參加0．7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時參加MTT(5mg/ml)50l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔參加1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。在570nm波長處測定吸光度(A)值。最后用加ConA孔的A值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。1．2．2．3綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反響(DTH)于試驗開場后第26d，每只小鼠腹腔注射0．2ml2%(v/v)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，免疫4d后，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC，每只鼠20l(約1108個SRBC)，注射后24h測量左后足跖部厚度，求得足跖部厚度前后差值。1．2．2．4小鼠血清溶血素測定(血凝法)每只鼠腹腔注射0．2ml2%(v/v)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，進(jìn)行免疫。5d后，取血離心，收集血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，37℃溫箱孵育3d，觀察抗體凝集反響程度，計算抗體積數(shù)。1．2．2．5抗體生成細(xì)胞測定(Jerne改進(jìn)玻片法)于試驗開場后第25d，每只鼠腹腔注射0．2ml2%(v/v)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，進(jìn)行免疫。5d后，每只鼠制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5106個/ml。將表層培養(yǎng)基(1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml)加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量pH7．2～7．4。2倍濃度的Hank＇s液混合，分裝小試管，每管0．5ml，再向管內(nèi)加50l10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20l脾細(xì)胞懸液(5106個/ml)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1h～1．5h，然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1:8)參加到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1h～1．5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。1．2．2．6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗于試驗期末，各動物處死前30min，每鼠腹腔內(nèi)注射20%(V/V)雞紅細(xì)胞懸液1ml，處死后再注入2ml生理鹽水，取腹腔液滴片，38℃溫箱孵育30min，固定，染色，鏡檢，計數(shù)100個巨噬細(xì)胞，計算吞噬率及吞噬指數(shù)。【1】1．2．2．7小鼠碳廓清試驗于實驗期末，小鼠尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3倍～4倍的印度墨汁，按每10g體重0．1ml計算。注入墨汁后2min、10min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20l，并將其加到2ml0．1%Na2CO3溶液中，在600nm波長處測A值，以Na2CO3溶液作空白對照。第2次采血結(jié)束后，立即處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器外表血污，稱重。計算吞噬指數(shù)。吞噬指數(shù)a=體重/(肝重+脾重)K1/3，K=(1gA1－lgA2)/(t2－t1)，t2－t1代表2次取血時間之差，lgA1－lgA2代表2次血樣測得光密度對數(shù)值之差。1．2．2．8NK細(xì)胞活性測定于實驗期末，每只鼠制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2107個/ml。試驗前24h將YAC－1細(xì)胞(靶細(xì)胞)傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前用Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4105個/ml。取靶細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液(效應(yīng)細(xì)胞)各100l(效靶比50∶1)，參加U型96孔培養(yǎng)板中，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100l，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40各100上述各項均設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，離心，每孔汲取上清100l置平底96孔培養(yǎng)板中，同時參加LDH基質(zhì)液100l，反響7min，每孔參加1mol/L的HCl30l，在490nm波長處測A值，計算NK細(xì)胞活性。【2】1．2．3數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x珋s)表示，采用SPSS15．0(AuthorizationCode:dl1757dc896b06088f1)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比擬采用SNK．q檢驗。按單因素方差分析的模型假設(shè)先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，對方差齊性的數(shù)據(jù)直接進(jìn)行分析，對方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待知足方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)=0．05。2實驗結(jié)果2．1受試物對小鼠實驗期體重及體重增重的影響實驗數(shù)據(jù)符合方差齊性要求(P＞0．05)，EVATHG0．5g/kg、1．0g/kg、2．0g/kg劑量組小鼠實驗期體重及體重增重與陰性對照組和野生型苜蓿組比擬，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。表示清楚EVATHG對小鼠體重及體重增重?zé)o明顯影響(圖1、圖2)?！緢D1-2】2．2受試物對小鼠免疫器官臟體比的影響實驗數(shù)據(jù)符合方差齊性要求(P＞0．05)，EVATHG三劑量組小鼠胸腺/體重比值及脾臟/體重比值與陰性對照組和野生型苜蓿組比擬，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。表示清楚EVATHG對小鼠主要免疫器官胸腺和脾臟重量無明顯影響(表1)?！颈?】2．3受試物對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響實驗數(shù)據(jù)符合方差齊性要求(P＞0．05)，與陰性對照組相比，EVATHG1．0g/kg、2．0g/kg劑量組及野生型苜蓿組均能提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力(P＜0．05)。EVATHG三劑量組與野生型苜蓿組比擬，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。EVATHG三劑量組小鼠左后足跖部厚度差24h測量值與陰性對照組和野生型苜蓿組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)(表2)。提示EVATHG能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖，加強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，而對小鼠的變態(tài)反響強(qiáng)度無明顯影響。這與野生型苜蓿組的結(jié)果基本一致?！颈?】2．4受試物對小鼠體液免疫功能的影響實驗數(shù)據(jù)符合方差齊性要求(P＞0．05)。與陰性對照組比擬，EVATHG三劑量組及野生型苜蓿組小鼠血清溶血素抗體積數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義差異(P＜0．05)，而小鼠溶血空斑數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義差異(P＞0．05)。=與野生型苜蓿組比擬，EVATHG三劑量組小鼠血清溶血素抗體積數(shù)值與溶血空斑數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)(表3)。表示清楚EVATHG能提高小鼠血清溶血素抗體滴度水平，而對抗體生成細(xì)胞數(shù)則沒有影響。這與野生型苜蓿組的結(jié)果一致?！颈?】2．5受試物對小鼠非特異性免疫功能的影響實驗數(shù)據(jù)符合方差齊性要求(P＞0．05)，華而不實吞噬率通過X=Sin－1P1/2轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)符合方差齊性要求(P＞0．05)。與陰性對照組和野生型苜蓿組比擬，EVATHG三劑量組小鼠碳廓清能力吞噬指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，NK細(xì)胞活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)(表4)。表示清楚EVATHG對小鼠碳廓清能力、巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞活性均無影響，試驗結(jié)果均為陰性?！颈?】2．6EVATHG對小鼠免疫器官病理組織學(xué)改變的影響脾臟:脾臟被膜完好，組織構(gòu)造及細(xì)胞形態(tài)正常，見圖3A。與陰性對照組比擬，EVATHG2．0g/kg組有2例小鼠脾動脈淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞增生(圖3B)。胸腺:胸腺被膜完好，皮質(zhì)內(nèi)胸腺細(xì)胞分布正常，淋巴細(xì)胞和上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞清楚明晰可見。髓質(zhì)內(nèi)可見胸腺小體，未見異常。EVATHG三劑量組小鼠胸腺組織切片與對照組一致，未見病理改變(圖3C、圖3D)。【圖3略】3討論免疫系統(tǒng)是機(jī)體實現(xiàn)免疫功能的重要系統(tǒng)，由免疫細(xì)胞、免疫分子和免疫器官構(gòu)成，它們協(xié)同完成細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能。當(dāng)遭到抗原刺激后，細(xì)胞免疫通過T細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞并構(gòu)成細(xì)胞因子來辨別和去除異物，發(fā)揮免疫保衛(wèi)作用，介入遲發(fā)型變態(tài)反響。脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能、遲發(fā)性變態(tài)反響性是反映細(xì)胞免疫功能的基本指標(biāo)。體液免疫通過產(chǎn)生抗體來對抗抗原物質(zhì)。一個溶血空斑的構(gòu)成代表一個抗體生成細(xì)胞，溶血素的多少反映抗體的生成量，因而這兩個指標(biāo)能反映機(jī)體的體液免疫功能。單核－巨噬細(xì)胞的吞噬能力的強(qiáng)弱及NK細(xì)胞活性則代表機(jī)體非特異性免疫功能。兼顧非特異性免疫和特異性免疫，細(xì)胞免疫和體液免疫相結(jié)合的原則，本次研究采用了反映細(xì)胞免疫功能的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和遲發(fā)型變態(tài)反響試驗，反映體液免疫功能的抗體生成細(xì)胞和血清溶血素測定、反響單核－巨噬細(xì)胞功能的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗和小鼠炭廓清實驗以及反響自然殺傷細(xì)胞活性的NK活性測定以及反映免疫器官損傷情況的中樞免疫器官胸腺、周圍免疫器官脾臟的病理組織學(xué)檢查等一組試驗，以期從多方面討論EVATHG對機(jī)體免疫機(jī)能的影響，對EVATHG的免疫毒性進(jìn)行初步探尋求索。本研究表示清楚:與陰性對照組相比，EVATHG可明顯提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、增加小鼠血清溶血素抗體積數(shù)值。病理組織學(xué)檢查未見EVATHG對免疫器官脾和胸腺有損傷作用。這與野生型苜蓿組的結(jié)果基本一致。但EVATHG2．0g/kg組，有少量動物脾動脈淋巴鞘增厚，淋巴細(xì)胞增生，這可能與EVATHG的免疫源性有關(guān)。苜蓿中含有皂甙、多糖、異黃酮等多種生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)會對機(jī)體免疫機(jī)能產(chǎn)生影響。苜蓿中含有的活性多糖可作為免疫佐劑，有加強(qiáng)免疫功能和抗感染作用，能顯著提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。劉晴雪等采用體外培養(yǎng)方式方法，將不同濃度的苜蓿多糖分別參加到用ConA刺激的仔雞外周血、胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞中，結(jié)果表示清楚苜蓿多糖在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)雞仔外周血及胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖。王麗榮等報道，水溶性苜蓿多糖對艾維茵雞巨噬細(xì)胞吞噬功能影響不顯著，但對T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有明顯的促進(jìn)作用，對雞血清中抗體滴度也有增高作用。苜蓿中含有的異黃酮亦屬于植物源免疫調(diào)節(jié)劑，具有提高機(jī)體的免疫力的生物活性作用。韓彥彬等研究發(fā)現(xiàn)苜蓿異黃酮能明顯刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，以及提高小鼠血清溶血素水平。龍銳等也研究了異黃酮對小鼠生長和免疫功能的影響，結(jié)果顯示苜蓿異黃酮能夠顯著促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖。上述研究結(jié)果講明，EVATHG的對小鼠體液免疫及細(xì)胞免疫存在一定的影響，這種影響與野生型苜蓿對照組的實驗結(jié)果一致。提示EVATHG對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力加強(qiáng)作用及血清溶血素抗體積數(shù)值提高作用，很可能與苜蓿本身含有的苜蓿多糖、異黃酮等活性成分有關(guān)，而與轉(zhuǎn)入的外膜小蛋白(S)及中蛋白(S2S)抗原基因無關(guān)。綜合上述，EVATHG對小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能無抑制作用，對單核－巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性也沒有影響，但與野生型苜蓿一樣對T淋巴細(xì)胞的增殖、血清溶血素抗體水平有加強(qiáng)和提高作用。在本實驗條件下，可初步以為EVATHG不會引起免疫系統(tǒng)功能的損害，未見有明顯的免疫毒性。以下為參考文獻(xiàn)［1］GanemD，PrinceAM．HepatitisBvirusinfectionnaturalhistoryandclinicalconsequences［J］．NEnglJMed，2004，3