骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與Ⅱ型膠原修飾的 4700字

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與Ⅱ型膠原修飾的4700字【摘要】?jī)?yōu)化骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)體外別離培養(yǎng)技術(shù)，改進(jìn)生物材料聚乙醇酸-乳酸共聚物(polylactide《coglycolide，PLGA)的細(xì)胞黏附性，察看BMSCs與Ⅱ型膠原修飾的PLGA的黏附性。［辦法］密度梯度離心法別離BMSCs，流式細(xì)胞分析法(FACS)對(duì)細(xì)胞外表抗原、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，相差顯微鏡察看細(xì)胞形態(tài)。相別離法制做PLGA，Ⅱ型膠原進(jìn)行外表修飾，取第三代干細(xì)胞與PLGA附和，掃描電鏡察看細(xì)胞與材料的黏附情況。［結(jié)果］BMSCs可在體外別離擴(kuò)增，敘述CD29、CD44和CD106，不敘述CD34和CD45，細(xì)胞活力為88.96％，G0《G1細(xì)胞占90.32％。細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，Ⅱ型膠原外表修飾的PLGA平均孔徑為100μm，與BMSCs有較好的黏附性。［結(jié)論］BMSCs可在體外長(zhǎng)期、穩(wěn)定培養(yǎng)，是理想的組織項(xiàng)目種子細(xì)胞。Ⅱ型膠原外表修飾的PLGA與干細(xì)胞有較好的黏附性，可用來(lái)做組織項(xiàng)目生物材料。

組織項(xiàng)目修復(fù)受損組織的根本辦法就是將種子細(xì)胞種植于生物支架材料上，經(jīng)體外培養(yǎng)一定時(shí)間后再植入體內(nèi)到達(dá)修復(fù)和重建受損組織的目的，所以細(xì)胞與生物支架材料的黏附性就成了構(gòu)建組織項(xiàng)目化組織和器官的關(guān)鍵問(wèn)題之一。本研究將體外提純，擴(kuò)增的BMSCs種植到經(jīng)Ⅱ型膠原修飾的PLGA材料上聯(lián)合培養(yǎng)，掃描電鏡察看其黏附情況，察看Ⅱ型膠原修飾的PLGA材料的細(xì)胞親和性，探索以BMSC為種子細(xì)胞，以Ⅱ型膠原修飾的PLGA為生物支架材料構(gòu)建組織項(xiàng)目的可行性，為臨床組織項(xiàng)目的應(yīng)用研究提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料和辦法

1.1材料和儀器

SD大鼠(廣東省動(dòng)物中心)；PLGA(濟(jì)南邁康公司，分子量10萬(wàn)單位)；胎牛血清(FBS)、淋巴細(xì)胞別離液(天津TBD公司)；DMEM(Dulbecdominimumessentialmedium)干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原(Sigma公司)；流式細(xì)胞儀FACSAria(美國(guó)BD公司)；CD29FITC、CD44FITC、CD106PE、CD34PE和CD45FITC(Ancell公司)；PI(Sigma公司)；掃描電鏡(日立公司，日本)。

1.2PLGA的制備合成及掃描電鏡察看

70∶25的PLGA溶解于二氧六環(huán)勻速攪拌3h，溶液澆鑄平皿上，-20℃放置過(guò)夜，放入質(zhì)量比為30∶70的酒精溶液中萃取8h，連續(xù)3次，將結(jié)塊樣品放入真空機(jī)冷凍枯燥。制備成10mm×10mm×5mm大小的樣品，將上述得到的樣品10個(gè)放入含5mgⅡ型膠原的5mlPBS溶液中振蕩混合1h，入真空機(jī)冷凍枯燥。質(zhì)量法測(cè)定其孔隙率［1］。取小塊PLGA材料，固定于2％的戊二醛24h，0.1mol/LPBS(pH7.2)洗3次，不同梯度酒精逐級(jí)枯燥，樣品鍍金，電鏡掃描。

1.3BMSCs的體外培養(yǎng)

1個(gè)月齡SD大鼠，脫頸處死，取雙側(cè)股骨，剔凈軟組織，75％酒精浸泡消毒5min，PBS洗2次，剪斷股骨一端后，用帶5號(hào)針頭的注射器將體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的DMEM(含100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素和20U／ml肝素)沖洗股骨骨髓腔，取混合骨髓液4ml遲緩注入事先準(zhǔn)備好的含6ml的淋巴細(xì)胞別離液的離心管內(nèi)，800g離心20min，取出中間層的單核細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。5d后首次換液，以后每隔3d換液，長(zhǎng)滿后傳代，取P3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4BMSCs的形態(tài)學(xué)察看

原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，用倒置相差顯微鏡逐日察看細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況及形態(tài)特征。

1.5BMSCs的鑒定

FACS檢測(cè)BMSCs的外表抗原，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P４細(xì)胞消化別離(37℃，3～5min)，收集細(xì)胞制成1×106個(gè)細(xì)胞／ml的細(xì)胞懸液。參加500μl適當(dāng)稀釋度的FITC標(biāo)記抗人CD29、CD44、CD45單克隆抗體，PE標(biāo)記抗人CD34和CD106單克隆抗體，反饋30min后檢測(cè)。

1.6BMSCs的生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞周期及活力的檢測(cè)

取P1、P3、P5的細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞／ml接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每天同一時(shí)間消化3孔計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)8d繪制生長(zhǎng)曲線。收集P3細(xì)胞，制成1×106個(gè)細(xì)胞／ml的細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS對(duì)BMSCs的細(xì)胞活力和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。

1.7BMSCs與Ⅱ型膠原修飾的PLGA復(fù)合

取P3細(xì)胞，調(diào)整濃度為106個(gè)細(xì)胞／ml。已制作好的支架材料經(jīng)60Co消毒后用無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，培養(yǎng)箱內(nèi)晾干，把PLGA放于24孔板的孔底，滴加100μl的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1h后翻轉(zhuǎn)，再在另一面滴加100μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1h后加培養(yǎng)基淹沒(méi)整個(gè)基質(zhì)材料，每周換液2次，體外培養(yǎng)2周，分別在復(fù)合后1、7、14d取材，作掃描電鏡察看。

2結(jié)果

2.1Ⅱ型膠原修飾的PLGA掃描電鏡察看

合成的復(fù)合PLGA為多孔的三維立體結(jié)構(gòu)，電鏡掃描可見：PLGA內(nèi)部形成大小不一的大孔和互連的小孔，彼此相互交通，支架四處均可見白色的微小Ⅱ型膠原顆粒(圖1)。應(yīng)用質(zhì)量法測(cè)得的孔隙率為90％，孔徑在50～200μm之間，平均孔徑為100μm。

2.2BMSCs形態(tài)學(xué)察看

原代細(xì)胞的察看：剛接種的細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液中，8～10h開始逐漸沉降貼壁，48h少數(shù)貼壁細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣外形，3～5d貼壁細(xì)胞開始增殖呈克隆生長(zhǎng)，5～7d后局部細(xì)胞成細(xì)胞團(tuán)簇，細(xì)胞多為梭形，胞核明顯為卵圓形或圓形?？梢?～3個(gè)核仁，胞質(zhì)豐盛、胞漿清晰。原代培養(yǎng)12d可長(zhǎng)滿瓶底。培養(yǎng)液中的渣滓隨換液被逐漸去除。

傳代細(xì)胞的察看：傳代后的細(xì)胞增殖迅速，2～4h開始貼壁，6～8h貼壁根本完全，于3d細(xì)胞數(shù)量開始明顯增多，5～6d可長(zhǎng)滿瓶底，融合成片狀，細(xì)胞排列更加整齊，細(xì)胞均勻分布，生長(zhǎng)較均勻一致，雜細(xì)胞已較少(圖2)。傳6代以上的細(xì)胞可見胞體增大，胞質(zhì)稀薄，細(xì)胞的增殖速度較以前已有所減慢。傳至9～10代細(xì)胞已出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象。

2.3BMSCs鑒定

流式細(xì)胞外表抗原標(biāo)志，CD29敘述為97.98％，CD106敘述為63.38％，CD44敘述為52.61％，CD34敘述為0.66％，CD45敘述為0.57％(圖3a、b、c)。

2.4BMSCs生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞周期及活力的檢測(cè)

2.4.1生長(zhǎng)曲線P1、P3、P5BMSCs在接種的0～1d細(xì)胞處于潛伏期，2d細(xì)胞開始增殖，3d進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，從5d開始進(jìn)入平臺(tái)期(圖4)。

2.4.2細(xì)胞周期及活力FACS檢測(cè)P3細(xì)胞的活力為88.96％(圖5)，細(xì)胞周期中G0《G1：90.32％，G2-M：8.03，S：1.50％，G2／G：0.15(圖6)。

2.5BMSCs與Ⅱ型膠原修飾的PLGA復(fù)合及增殖

掃描電鏡察看發(fā)現(xiàn)BMSCs復(fù)合到Ⅱ型膠原修飾的PLGA支架后2d，即在PLGA基質(zhì)材料上黏附和伸展，呈成纖維樣細(xì)胞。7d時(shí)細(xì)胞數(shù)量已明顯增多，與支架材料結(jié)合較緊密(圖7)。14d時(shí)，細(xì)胞增殖，相互間融合，并有大量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，大局部材料顆粒被覆蓋(圖8、9)。

3討論

骨基質(zhì)材料是骨組織項(xiàng)目的關(guān)鍵構(gòu)成要素。相對(duì)于不可降解的骨基質(zhì)材料(如HA)，可降解的生物材料在植入體內(nèi)后能最終被再生組織所取代，勿需2次手術(shù)取出，成為臨床上較為常用的骨替代品。PLGA是乳酸和乙醇酸聚合而成，是目前國(guó)內(nèi)外常用的支架材料［2］，其結(jié)構(gòu)及親水、疏水性可以通過(guò)兩者的不同比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而決定支架材料在體內(nèi)的降解速率［3］，它在體內(nèi)降解的最終代謝產(chǎn)物為CO2和H2O，不在體內(nèi)蓄積，幾乎沒(méi)有毒副作用，已被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于縫線、暫時(shí)性支架和藥物緩釋載體［4］。膠原是一種軟、硬組織項(xiàng)目經(jīng)常使用的天然材料，它可以增強(qiáng)細(xì)胞的黏附效果、防止反饋物反饋、增加生物的平安性，HosokawaR［5］等人已把膠原用來(lái)作為bFGF、NGF、IGF《α等的載體，并取得較好的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)用物理辦法用Ⅱ型膠原修飾PLGA，增加它的細(xì)胞黏附性，改進(jìn)其生物活性，本實(shí)驗(yàn)所制作的PLGA孔徑在50～200μm之間，平均為100μm，完全合乎YaylaogluMB［6］等人得出的結(jié)論“支架材料的孔徑略大于擬植入細(xì)胞的大小〞。

BMSCs是一種存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，具有分化成各種間葉組織的功能。近年來(lái)研究說(shuō)明BMSCs體外別離培養(yǎng)后，在一定的誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等定向分化的能力［7］，BMSCs為貼壁細(xì)胞，它外表標(biāo)志并非單一性，它敘述間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的外表標(biāo)志，BMSCs能夠不斷自我復(fù)制而不分化，在其增殖分化過(guò)程中外表標(biāo)志不斷變化。一般認(rèn)為整合素家族成員CD29,黏附分子CD44,CD106等是BMSCs保持未分化狀態(tài)時(shí)較為特異性的外表標(biāo)志［8］，雖然BMSCs與造血細(xì)胞共同存在于骨髓中，但不敘述造血系統(tǒng)的標(biāo)志，如CD14、CD34及白細(xì)胞共同抗原CD45。本實(shí)驗(yàn)從骨髓中別離貼壁生長(zhǎng)的BMSCs,流式細(xì)胞儀分析第4代BMSCs強(qiáng)敘述CD29，敘述CD44和CD106，而不敘述CD34、CD45，證實(shí)其為BMSCs應(yīng)用單核細(xì)胞別離液從骨髓中別離貼壁生長(zhǎng)的BMSCs是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、有效的別離辦法。本實(shí)驗(yàn)中別離所得的BMSCs在低糖DMEM培養(yǎng)基中擴(kuò)增較迅速，具有較強(qiáng)的增殖能力，體外培養(yǎng)至第8代仍保持未分化狀態(tài)，為體外組織項(xiàng)目成骨提供了足夠的準(zhǔn)備時(shí)間。BMSCs作為骨組織項(xiàng)目中首選的種子細(xì)胞，具有取材方便，增殖能力、成骨能力強(qiáng)［9］，免疫原性弱［10，11］，基因容易導(dǎo)入等優(yōu)點(diǎn)，在目前骨組織項(xiàng)目中應(yīng)用非常普遍［12］。

細(xì)胞與基質(zhì)材料的相互作用也是組織項(xiàng)目研究的主要領(lǐng)域，其中細(xì)胞與材料的黏附是根底，細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)酿じ剑拍苓M(jìn)行遷移、增殖和分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：BMSCs接種到支架材料上后24h就已貼附、伸展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)掃描電鏡察看發(fā)現(xiàn)：復(fù)合PLGA支架上的BMSCs在3d已牢固地附著于材料外表，分泌胞外基質(zhì)，至復(fù)合后14d，BMSCs增殖明顯，細(xì)胞和分泌的胞外基質(zhì)已覆蓋材料大局部顆粒，提示BMSCs復(fù)合于PLGA后，其黏附、增殖和分化特性未受明顯影響。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用相別離法合成PLGA，經(jīng)Ⅱ型膠原修