鈣調(diào)蛋白的分離提純

動(dòng)物腦組織中鈣調(diào)蛋白的分離純化

小組分工講解人：郭智妍題目分析

已知某蛋白的分子量約為17kDa，等電點(diǎn)3.9~4.1，它能耐一定的高溫，在90C加熱3~4min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露它的疏水基團(tuán)。該蛋白的作用是作為生物體內(nèi)酶的激活劑。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)從腦組織中提取和分離純化該蛋白的實(shí)驗(yàn)方案，要求寫(xiě)出具體的步驟和理由以及檢測(cè)方法。1、鈣調(diào)蛋白2、酸性蛋白質(zhì)3、加熱變性沉淀法4、SDS陰離子表面活性劑0201材料的選擇和預(yù)處理0304精細(xì)純化05檢測(cè)鑒定實(shí)驗(yàn)方案細(xì)胞破碎目標(biāo)物的提取與分離（粗提?。?1材料的選擇和預(yù)處理

一、

材料的選擇和預(yù)處理材料的選擇預(yù)處理大鼠腦組織將切取的組織用4℃預(yù)冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS（磷酸鹽緩沖液）一、

材料的選擇和預(yù)處理緩沖液PH：一般來(lái)說(shuō)，提取蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)在遠(yuǎn)離其pI的pH條件下進(jìn)行，以不危及蛋白質(zhì)的化學(xué)屬性。蛋白酶抑制劑：動(dòng)物組織含有多種蛋白酶，它們會(huì)使所需的蛋白質(zhì)發(fā)生降解，在有些情況下還會(huì)改變它的活性。用蛋白酶抑制劑是很重要的。金屬離子抑制劑：組織中有不同的金屬離子，需利用螯合物（EDTA）與提取物中的蛋白質(zhì)及其他化合物的相互作用來(lái)去除這些金屬陽(yáng)離子。02

細(xì)胞破碎

二、

細(xì)胞破碎機(jī)械方法

主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有：①玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎）②高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片），宜用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破裂。物理方法主要通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。

Ⅰ反復(fù)凍融法Ⅱ冷熱變替法Ⅲ超聲波法化學(xué)及生物化學(xué)方法

二、

細(xì)胞破碎勻漿法勻漿法（屬于機(jī)械破碎）是指將適當(dāng)溶媒加入到新鮮的生物組織中，在勻漿攪拌刀的強(qiáng)力作用下，細(xì)胞液中的活性成分迅速溶出到溶媒中的過(guò)程。具有成分提取率高，能耗低，提取不加溫，提取速度快等優(yōu)點(diǎn)。03目標(biāo)物的提取與分離

三、

目標(biāo)物的提取勻漿液在4℃下14500r/min離心30min,收集上清液。沉淀物再用上述方法重新提取一次,合并上清液。差速離心法

三、

目標(biāo)物的分離鹽析沉淀法

利用鈣調(diào)蛋白在中性或略堿性pH及不存在鈣離子的條件下，鈣調(diào)蛋白高度可溶的特性。等電點(diǎn)沉淀法

在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度最低，會(huì)沉淀出來(lái)。加熱變性沉淀法鈣調(diào)蛋白能夠耐一定的高溫，而其他蛋白在高溫下會(huì)因加熱變性而凝固

三、

目標(biāo)物的分離鹽析沉淀法首先，用pH8.0條件下的硫酸銨溶液，把大部分蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)，而同時(shí)把鈣調(diào)蛋白留在上清液中。在中性或略堿性pH及不存在鈣離子的條件下，鈣調(diào)蛋白是高度可溶的。甚至在高鹽濃度（60%飽和硫酸銨）下，pH8.0時(shí)，該蛋白也能留在溶液中。等電點(diǎn)沉淀法

用50%硫酸將溶液的pH調(diào)至pH4.0~4.1之間。這可降低pH而不改變?nèi)芤褐械闹饕庪x子即硫酸根離子。需要加的酸體積很小，故可很快降低pH，避免其他蛋白質(zhì)在中間pH下沉出。加熱變性沉淀法加熱變性沉淀法：將蛋白質(zhì)溶于少量緩沖液（20mMTris-HCl，pH=7.0,1mM咪唑，1mMMgAC2,10uMCaCl2)中，加入少量蛋白酶抑制劑配成溶液，調(diào)pH=8.0，置于90℃水浴中煮沸3—4分鐘，冰水浴冷卻后離心，獲取上清液。04

精細(xì)純化

四、

精細(xì)純化透析：方法：將上清液在纖維素透析袋中透析。原理是：利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖等分開(kāi)。目的：去除蛋白液中的配體離子。離子交換層析：前提：鈣調(diào)蛋白是一種強(qiáng)酸性蛋白因而在中性或微堿性pH條件下帶有大量?jī)糌?fù)電荷。原理：在低離子強(qiáng)度條件下，鈣調(diào)蛋白會(huì)與帶正電荷的樹(shù)脂結(jié)合，而許多等電點(diǎn)較高的蛋白質(zhì)則不結(jié)合。然后，改變條件將結(jié)合的蛋白質(zhì)分別洗脫下來(lái)。親和色譜的洗脫05檢測(cè)鑒定

五、

檢測(cè)鑒定定性分析（1）分子量:電泳、質(zhì)譜(可同時(shí)鑒定分子量和純度)（2）活性:根據(jù)蛋白質(zhì)的功能選用不同的活性檢測(cè)方法定量分析（1）紫外檢測(cè)法：簡(jiǎn)單快速、不破壞樣品、準(zhǔn)確度低（2）考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）：簡(jiǎn)單迅速、干擾少、靈敏度高(1g)（3）Folin-酚試劑法（Lowry法）：靈敏度高、是常用的方法

五、

檢測(cè)鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將提純出來(lái)的鈣調(diào)蛋白在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。十二烷基硫酸鈉

五、

檢測(cè)鑒定（1）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量（2）質(zhì)譜法

五、

檢測(cè)鑒定23實(shí)驗(yàn)流程圖[1]王新生,李海峰,趙熒,趙鐵軍,張曉麗,薄愛(ài)華.黃芪誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化早期胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄水平[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,23:4495-4499.[2]梁秋芬,劉寬燦,徐碧玉,金志強(qiáng).鈣調(diào)蛋白在植物發(fā)育中的功能[J].生命科學(xué)研究,2005,S2:1-5.[3]蔣淑君,王桂蘭,崔存德,徐紅.淫羊藿總黃酮對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸鈣調(diào)蛋白基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2004,04:30+42.[4]