病毒標本采集和核酸檢測技術指南10-18-16

PAGEPAGE9病毒標本采集和核酸檢測技術指南為指導各級醫(yī)療衛(wèi)生機構和其他相關機構規(guī)范開展肺炎標本采集與實驗室檢測工作，確保檢測質量，提高檢測效率，特制定本指南。一、標本采集（一）采集對象。以及可能被污染的環(huán)境或物品等。（二）采樣人員基本要求。從事標本采集的技術人員應當經過生物安全和實驗室檢測（三）標本采集基本要求。的密接在住院、隔離觀察或健康監(jiān)測期間應“單采單檢”，即單獨采集個體的標本，單管進行核酸檢測，不得進行混采混檢。（四）采集標本種類。（上呼吸道標本：包括鼻咽拭子、口咽拭子等。便標本/10（花生大小如果不便于留取便標本，可采集肛拭子。5mlEDTA凝劑的真空釆血管采集血液。7）采集，第二份血清應當在發(fā)病后3～45ml2～3ml。其它：已有唾液等標本用于病毒檢測的報告。（五）標本采集和處理。（2～3ml（332～3ml（3ml（亦可用小兒導尿管50ml）。3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前2～3ml1。使用時將儲存液用去離子水稀釋至1g/LK表1痰液消化液儲存液配方成分 質量/體積二硫蘇醇 0.1g氯化鈉 氯化磷 磷酸氫鈉 磷酸二鉀 0.02g水PH值7.4±0.2（25℃） 7.5ml支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm）5ml50ml肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣30～50ml100～250ml300ml。1ml3～51052HANK’S患者出現腹瀉癥狀，則留取糞便標本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。表2 糞便標本處理液配方成分質量/體積Tris1.211g氯化鈉8.5g無水氯化鈣（或含結晶水的氯化鈣）1.1g（1.47g）水800ml用濃鹽酸調節(jié)pH為7.5，以去離子水補充至1000ml3～5cm，3～5ml15mlEDTA5ml，根據所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或1500～2000rpm105ml，301500～2000rpm10物體表面標本：參考《農貿（集貿）環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（WS/T776—2021）充分浸潤病毒保存液后在表面重復涂抹，將拭子放回采樣管浸3進行多點分布式采樣。富集濃縮和核酸檢測方法標準》（WS/T799-2022），300ml?？筛鶕F場條件和檢測需求確定水樣采集方式，如瞬時水樣（采樣點位某一時間隨機采集的樣本）或混合水樣（同一采樣點位不同時間所采集的瞬時水樣混合后的樣本）；如農貿（集貿）市場內排水溝內無法采集足夠體積水樣，可采集污水的拭子標本，參考《農貿（集貿）市場環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（WS/T776-2021）推薦的方法，用拭子浸入吸附污水，將拭子3個污水采樣位置應進行多點分布式采樣。其他材料：如唾液等標本，依據檢測需求采集。（六）標本包裝。標本采集后應在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。及采樣日期。涉及外部標本運輸的，應根據標本類型，按照AB類感染性物質進行三層包裝。（七）標本保存。用于病毒分離和核酸檢測的標本應當盡244℃（2℃～8℃）保存；2470℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）4℃320℃以下可長期保存。境外高風險區(qū)域人群以及肺炎患者的密切接觸者等人員的核酸檢測標本，檢測后，應當在-2074℃保存24（八）標本送檢。標本采集后應當盡快送往實驗室，標本采集后室溫（25℃）放置不宜超過4小時。如果需要長途運輸，應采用干冰保藏，難以獲取干冰時，可使用冰袋、冰排等低溫運輸。1.送檢標本。各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）發(fā)現的本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學關聯的關鍵病例、感染來源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關環(huán)212-1）。各省分離到的新的代表性毒株，應及時送中國疾控中心病毒病所復核、保藏。2.標本及毒株運輸。AUN2814，包裝符合國際民Doc9284《危險物品安全航空運輸技術細則》的PI620BUN3373Doc9284《危險物品安全航空運輸技術細則》的PI650（毒）種或標本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號）辦理《準運證書》。國際運輸。在國際間運輸的病毒標本或毒株，理相關手續(xù)，并滿足相關國家和國際相關要求。抵達目的地機場后，由專業(yè)運輸車輛運送至接收單位，通過陸路運輸的標本由專業(yè)車輛進行運送，運送人員和接收人員應對標本進行雙簽收。毒株的來源、種類、數量，編號登記，采取有效措施確保毒株和標本的安全，嚴防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。二、病毒的實驗室檢測PAGEPAGE16（一）檢測人員要求。實驗室檢測人員應當具有實驗室工作經歷以及相關專業(yè)技術技能，接受過病毒相關檢驗檢測技能培訓。檢測機構應當按照所開展檢測項目及標本量配備實驗室檢測人員，以保證及時、高效完成檢測和結果報告。（二）實驗室檢測。1.實時熒光RT-PCR方法檢測病毒核酸。位置的不同，可分為集中布置形式和分散布置形式。開展病毒核酸檢測的實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增和產物分析區(qū)。根據使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。如采用標本加樣、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，標本制備區(qū)、擴增和產物分析區(qū)可合并。集中布置形式的實驗室設置應遵循“各區(qū)獨立，單向流動（注意風向，壓力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原則。各區(qū)的功能如下：①試劑儲存和準備區(qū)：用于分裝、儲存試劑、制備擴增反應混合液，以及儲存和準備實驗耗材。該區(qū)應配備冰箱或冰柜、離心機、試驗臺、渦旋振蕩器、微量加樣器等。為防止污染，該區(qū)宜保持正壓狀態(tài)。②標本制備區(qū)：標本轉運桶的開啟、標本滅活（必要時）、核酸提取及模板加入至擴增反應管等。該區(qū)應配備冰箱或冰柜、生物安全柜、離心機、試驗臺、微量加樣器，可根據實際工作需要選配自動化核酸提取儀等。標本轉運桶的開啟、分裝應在生物安全柜內完成。為防止污染，該區(qū)宜保持負壓狀態(tài)。為操作方便，標本的分裝以及核酸提取也可以在獨立的生物安全二級（BSL-2）實驗室進行，提取的核酸可以轉運至該區(qū)加至擴增反應液中。③核酸擴增和產物分析區(qū)：進行核酸擴增反應和產物分析。該區(qū)應配備實時熒光定量PCR該區(qū)宜保持負壓狀態(tài)，壓力等于或低于標本制備區(qū)。RT-PCRSOP本后，應當在生物安全柜內對標本進行清點核對，并依據SOP進行試劑準備、標本前處理、核酸提取、核酸擴增、結果分析及報告。實驗室應當建立可疑標本復檢的流程。①試劑準備。應當選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準的試劑，建議根據核酸提取試劑及擴增體系的要求選擇配套的標本采樣管，不建議免提取核酸直接進行核酸擴增反應。②標本處理。使用含胍鹽等滅活型采樣液的標本無需進行滅活處理，可直接進行核酸提取，而使用非滅活型采樣液的標本，按照核酸提取試劑盒的說明，取適量標本加至核酸提取裂解液中充分混勻作用一定的時間則可以有效滅活病毒。選用熱951556℃30污水水樣標本處理可參考《污水中富集濃縮和核酸檢測方法標準》（WS/T799-2022）推薦的方法；污水拭子標本處理可參考《農貿（集貿）市場環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（WS/T776-2021）推薦的方法。③核酸提取。將滅活后的標本取出，在生物安全柜內打開標本采集管加樣，或按照核酸提取試劑盒的說明，將標本與裂解液作用足夠時間后繼續(xù)核酸提取步驟，核酸提取完成后立即封蓋。取適量核酸加至PCR擴增反應體系中。PCR可開蓋，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高壓，按一般醫(yī)療廢物轉移出實驗室處理。檢測機構所選用的病毒核酸檢測試劑應針對病毒基因組中開放讀碼框1ab（openreadingframe1ab，ORF1ab）和核衣殼蛋白（nucleocapsidprotein，N）基因，人體標本檢測原則上選擇含內源性內參的核酸檢測試劑。⑤陽性標本的確認。實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：2（ORF1ab、N）RT-PCR條件二：兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現單靶標陽性，或同種類型標本兩次采樣檢測中均出現單個靶標陽性的檢測結果，可判定為陽性。環(huán)境與生物材料核酸檢測陽性要排除疫苗接種物殘留污染的影響。核酸檢測結果假陰性的可能原因包括：標本質量差；標本采集時間過早或過晚；標本保存、運輸和處理不當；其他原因如病毒變異、PCR抑制等。⑥質控。由上級疾控部門對下級疾控實驗室進行核酸檢測質控考核，中國疾控中心每年至少開展一次對省級疾控機構實驗室的質控考核，并同時提供全國病毒實驗室檢測質控方案，省級針對地市級實驗室的質控考核每年不少于兩次。各檢測機構應當加強核酸檢測質量控制，選用擴增檢測試劑盒指定的核酸提取試劑和擴增儀。性能驗證。臨床標本檢測前，實驗室應對核酸提取試劑、提取儀、擴增試劑、擴增儀等組成的檢測系統(tǒng)進行必要的性能驗證，性能指標包括但不限于精密度（至少要有重復性）和最低檢測限。室內質控。實驗室可按照《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于醫(yī)療機構開展核酸檢測有關要求的通知》（國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕53）要求規(guī)范開展室內質控。每批檢測至少有1（1.5-3倍）、3份陰性質控品（生理鹽水）。質控品隨機放在臨床標本中，參與從提取到擴增的全過程。大規(guī)模人群篩查時，一旦出現陽性結果，應對陽性標本采用另外一到兩種更為靈敏的核酸檢測試劑對原始標本進行復核檢測，復核陽性方可報出。物品和環(huán)境標本的采集檢測，還需在采樣前及采樣過程中至少設一個現場空白標本及一個運輸空白標本，以進行過程中的質量控制。室間質評。實驗室應常態(tài)化參加國家級或省級疾控機構組織的室間質評。對檢測量大以及承擔重點人群篩查等任務的實驗室，可適當增加室間質評頻率。不按要求參加室間質評的，或室間質評結果不合格的，應通報批評并上報國家衛(wèi)健委，待室間質評通過后方可開展核酸檢測。核酸檢測實驗室質控詳細內容參見《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于加強疾控機構病毒核酸檢測實驗室質量控制的通知》（國衛(wèi)辦疾控函〔2021〕548號）《疾控機構病毒核酸檢測質量控制方案》。供實驗數據，同時也為流調溯源工作提供支持。測序標本選取原則。結合流調信息和病例傳播鏈關系，Ct32中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學關聯的關鍵病例、感染來源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關環(huán)境陽性標本、疫苗接種后核酸檢測陽性者標本等。測序結果應與本地近一個月的輸入病例和本土病例序列進行比對。對同一傳播鏈或流行病學關系明確的病例無需全部測序。測序要求。①測序單位和流程。以省、自治區(qū)、直轄市為單位確定開展病毒全基因組測序的機構，包括省級疾控機構和科研機24作。不具備測序條件的省份要及時將標本送至病毒病所，病毒病所收到標本后及時啟動序列測定工作。②結果報告與反饋。各省份要建立本省輸入、本土病例病毒基因組數據庫，及時進行序列比對分析，逐步提高自主分析能力。獲得的全部測序數據都必須上報中國疾控中心病毒病所用于我國病毒溯源數據庫的更新與維護。對本土疫情的指示或首發(fā)病例、本土疫情中由不同基因型的毒株導致的新2448結果；對本土疫情中歸屬已知傳播鏈的病例、境外輸入病例、環(huán)境標本（非指示或首發(fā)病例相關），測序數據于每周周一上午集中上報，病毒病所確認數據完整無誤后于一周之內反饋結果。血清抗體檢測。血清抗體檢測用作病毒核酸檢測的補充檢測，也用于評估疫苗接種后誘發(fā)的免疫反應。應采用中國藥品監(jiān)督管理局批準的試劑進行檢測，采集急性期（發(fā)病7天內）和恢復期（3-4周后）雙份血清進行檢測，也可根據臨床需要確定采集時間，疑似病毒感染者抗體檢測陽性時應排除疫苗接種因素的影響。病毒分離培養(yǎng)。Ct309696毒病所保存?zhèn)浒?，并將毒株序列等相關信息報送病毒病所。不489696抗原檢測。不具備開展核酸檢測條件的基層醫(yī)療衛(wèi)生機構、隔離觀察人員和有抗原自我檢測需求的社區(qū)居民可以進行抗原檢測。抗原檢測不作為確診病例或無癥狀感染者診斷的依據，僅用作核酸檢測方法的補充，實現“快篩快檢”，提高感染者發(fā)現的及時性。具體實施流程及要求參照《病毒抗原檢測應用方案（試行）》（聯防聯控機制綜發(fā)﹝2022﹞21）執(zhí)行。三、實驗室活動Th物安全要求根據病毒傳播特性、致病性和臨床資料等信息，該病毒按照第二類病原微生物進行管理，具體要求如下：（一）實驗活動規(guī)范。病毒培養(yǎng)、動物感染實驗應當在生物安全三級及以上實驗室開展；未經培養(yǎng)的感染性材料的操作應當在生物安全二級及以上