學(xué)習(xí)情境淀粉酶

學(xué)習(xí)情境淀粉酶第一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

淀粉是由許多葡萄糖分子以α—1．4或α—1．6糖苷鍵連接而成的大分子物質(zhì)。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉之分。第二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日淀粉酶定義：淀粉酶是指一類能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷鍵的酶之總稱。包括：α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫支酶、麥芽寡糖生成酶等水解酶類和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等。第三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)α—淀粉酶第二節(jié)β—淀粉酶第三節(jié)葡萄糖淀粉酶第四節(jié)脫支酶第四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)α—淀粉酶(EC3．2．1．1系統(tǒng)名：α—1.4葡聚糖—4—葡聚糖水解酶)α—淀粉酶是一種內(nèi)切酶，它隨機(jī)地從分子內(nèi)部切開α—1．4糖苷鍵(水解中間的α—1．4鍵比分子末端的α—1．4鍵概率大)，遇到分支點(diǎn)的α—1．6鍵不能切，但能跨越分支點(diǎn)而切開內(nèi)部的α—1．4糖苷鍵，由于產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖殘基上的C1碳原子呈α—構(gòu)型(光學(xué))，故稱這種酶為α—淀粉酶。第五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日一、α—淀粉酶的水解反應(yīng)二、α—淀粉酶的基本性質(zhì)三、α—淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)第六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日一、α—淀粉酶的水解反應(yīng)淀粉在α—淀粉酶的作用下很快被切割成分子較小的糊精、低聚糖、麥芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，對(duì)碘呈色反應(yīng)為籃－紫－紅－無(wú)色，又叫液化酶。第七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日水解產(chǎn)物：水解直鏈淀粉，首先將淀粉降解為寡糖、麥芽三糖和麥芽糖，然后將寡糖、麥芽三糖進(jìn)一步降解為麥芽糖和葡萄糖。水解支鏈淀粉，由于不能水解α-1.6糖苷鍵，產(chǎn)物除麥芽糖、少量葡萄糖外，還有帶α-1.6鍵的小分子極限糊精。第八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日二、α—淀粉酶的基本性質(zhì)（一）需要鈣離子（二）pH范圍（三）溫度范圍（四）水解極限（五）分子量及其氨基酸組成

第九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（一）需要鈣離子大多數(shù)α—淀粉酶需要鈣離子，鈣離子可使α—淀粉酶保持一定的空間構(gòu)象，并可增寬其pH范圍。NaCL與鈣離子同時(shí)存在，可顯著提高α—淀粉酶的穩(wěn)定性。第十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（二）pH范圍一般α—淀粉酶的穩(wěn)pH范圍為pH5-10，最適pH范圍為pH5-6。另有少量菌種pH范圍比較特殊。第十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（三）溫度范圍各種的熱穩(wěn)定性和最適溫度也有一定差異。地衣芽孢桿菌產(chǎn)α—淀粉酶熱穩(wěn)定性最好，最適溫度可達(dá)90℃。枯草桿菌產(chǎn)α—淀粉酶最適溫度為70℃。霉菌產(chǎn)α—淀粉酶最適溫度為50℃。擬內(nèi)孢霉所產(chǎn)α—淀粉酶最不穩(wěn)定，40℃即會(huì)失活。第十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（四）水解極限水解極限：當(dāng)水解液中還原性不再增加時(shí)的水解率，稱為該酶的水解極限。各種酶的水解極限隨產(chǎn)酶菌種不同有一定差異。水解不同來(lái)源的淀粉（支鏈、直鏈淀粉含量不同）水解極限也不同。第十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（五）分子量及其氨基酸組成α—淀粉酶的分子量約為50000左右，但不同來(lái)源的酶其分子量和氨基酸組成也有所不同，共同點(diǎn)是含硫氨基酸（如蛋氨酸、胱氨酸）較少，而二羰酸氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）含量較高。第十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日三、α—淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)目前工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)的α—淀粉酶主要來(lái)自枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、和米曲霉。(一)枯草桿菌BF—7658α—淀粉酶

(二)高溫α—淀粉酶(三)米曲霉固體培養(yǎng)法生產(chǎn)α—淀粉酶第十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日(一)枯草桿菌BF—7658α—淀粉酶1、菌種

2、發(fā)酵工藝

3、酶的提取第十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日1、菌種枯草桿菌BF—7658于60年代中期投入生產(chǎn)，經(jīng)一系列誘變后其產(chǎn)酶水平提高至500U/ml。（1）菌株形態(tài)呈短桿狀，兩端鈍圓，單獨(dú)或成鏈狀。（2）培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基：第十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日2、發(fā)酵工藝（1）斜面培養(yǎng)馬鈴薯斜面培養(yǎng)基，37℃

，3天，此時(shí)幾乎全部形成孢子，接入種子罐。（2）種子罐培養(yǎng)37℃，12-14h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（細(xì)胞密集、粗壯、整齊）。（3）發(fā)酵罐接種量5％，工藝特點(diǎn)為低濃度發(fā)酵高濃度補(bǔ)料。第十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日3、酶的提?。?）液體濃縮酶（2）酒精沉淀法制食品級(jí)酶（3）淀粉吸附酶（4）鹽析法制工業(yè)級(jí)粗酶

第十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（1）液體濃縮酶發(fā)酵液經(jīng)絮凝過(guò)濾后，用薄膜蒸發(fā)器濃縮5倍左右，加入食鹽18-20％，苯甲酸鈉％后再濾清，即為液體酶（室溫保存3個(gè)月，失活<10%）。第二十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（2）酒精沉淀法制食品級(jí)酶第二十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（3）淀粉吸附酶將濃縮10倍的酶液拌入淀粉，經(jīng)篩網(wǎng)搖擺造粒機(jī)成型，在沸騰床干燥而成顆粒狀制品，亦可將濃縮10倍的酶液添加2％的淀粉后噴霧干燥成粉狀酶。（4）鹽析法制工業(yè)級(jí)粗酶第二十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日(二)高溫α—淀粉酶：高溫α—淀粉酶是指熱穩(wěn)定性在90℃以上的α—淀粉酶，它適宜在高溫下（100-110℃）將淀粉液化。近年來(lái)高溫α—淀粉酶幾乎有完全取代枯草桿菌中溫α—淀粉酶的趨勢(shì)。

1、菌種

2、生產(chǎn)工藝

3、使用第二十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日1、菌種地衣芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫放線菌等第二十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日2、生產(chǎn)工藝以美國(guó)Miles公司生產(chǎn)Takatherm酶為例：（1）發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖、大豆粉、棉子粉等。（2）接種種齡40h的地衣芽孢桿菌（5％）通風(fēng)培養(yǎng)100h（3）壓濾、超濾、真空蒸發(fā)濃縮5倍（4）10℃下精濾除菌（5）加防腐劑，得到成品酶第二十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日提取流程：第二十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日3、使用最適溫度90-95℃

最適每噸淀粉用酶400-600ml，95-100℃

液化20min，可使30-40％淀粉糖漿液化，DE值（還原糖含量）為14-20。第二十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日(三)米曲霉固體培養(yǎng)法生產(chǎn)α—淀粉酶（1）斜面培養(yǎng)米曲汁或麥芽汁斜面培養(yǎng)基，32-34℃

，70-72h，此時(shí)幾乎菌絲全部布滿斜面，即成熟，接入種子瓶。（2）種子瓶培養(yǎng)（三角瓶）麥麩玉米粉培養(yǎng)基，32-34℃，70-72h，培養(yǎng)至長(zhǎng)出大量菌絲及黃綠色孢子。（3）種曲培養(yǎng)（曲盒）培養(yǎng)基與種子瓶相同，接種量％，料層厚1cm，培養(yǎng)3天。（4）厚層通風(fēng)培養(yǎng)麥麩谷殼培養(yǎng)基接種量0.5％，34-36℃

，28h。（5）產(chǎn)品培養(yǎng)好的麩曲直接烘干即為工業(yè)級(jí)粗酶，水浸醇沉后粉碎加糖可作為助消化藥物。第二十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日工藝流程第二十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)β—淀粉酶(EC3．2．1．2系統(tǒng)名：α—1．4葡聚糖麥芽糖水解酶)β—淀粉酶又稱外切型淀粉酶(exoamylase)，它是從淀粉的非還原性末端以麥芽糖為單位順次分解α—1．4糖苷鍵，同時(shí)使切下的麥芽糖還原性末端的葡萄糖殘基構(gòu)型轉(zhuǎn)變成β型，故稱為β—淀粉酶。β—淀粉酶不能水解α—1．6糖苷鍵，也不能跨越α—1．6糖苷鍵，水解作用在α—1．6鍵前2-3個(gè)葡萄糖殘基處停止。第三十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日一、來(lái)源二、β—淀粉酶性質(zhì)三、影響微生物β—淀粉酶產(chǎn)生的因素四、植物β—淀粉酶的提取第三十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日一、來(lái)源β—淀粉酶廣泛存在于大麥、小麥甘薯、大豆等高等植物中，目前商品β—淀粉酶絕大部份均是從植物中提取的，芽孢桿菌β—淀粉酶生產(chǎn)量極低。第三十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日二、β—淀粉酶性質(zhì)（一）最適pH：植物來(lái)源：pH5-6；細(xì)菌來(lái)源：pH6-7（二）作用位點(diǎn)：淀粉的非還原末端α—1．4糖苷鍵（三）β—淀粉酶為外切酶（四）作用淀粉時(shí)還原性增加，但粘度不易下降，糊化緩慢（五）β—淀粉酶較α—淀粉酶分子量大（六）水解作用：

1、直鏈淀粉：可以完全水解成麥芽糖

2、支鏈淀粉：麥芽糖和大分子β—極限糊精第三十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日三、影響微生物β—淀粉酶產(chǎn)生的因素（一）鈣離子對(duì)β—淀粉酶有降低穩(wěn)定性的作用（但可以增加α—淀粉酶活性）。（二）－SH的影響各種β—淀粉酶都含有－SH，－SH易受封鎖劑作用而使酶失活。第三十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日四、植物β—淀粉酶的提?。ㄒ唬滬熖崛ˇ隆矸勖福ǘ母适淼矸蹚U液中提取β—淀粉酶（三）從大豆蛋白質(zhì)廢水中提取β—淀粉酶第三十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)葡萄糖淀粉酶(EC3．2．1．3系統(tǒng)名：α—1．4葡聚糖葡萄糖水解酶)萄糖淀粉酶又稱糖化酶，是一種外切酶，它是從淀粉分子的非還原性末端依次水解α—1．4糖苷鍵切下葡萄糖，它亦可水解麥芽糖的α—1．4鍵和支鏈淀粉分支點(diǎn)的α－1．6鍵(只是水解速度極慢)，因此從理論上講，葡萄糖淀粉酶可將淀粉100％水解成葡萄糖，故大量用作淀粉的糖化劑。第三十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日一、糖化酶的類型與性質(zhì)（一）類型：其生產(chǎn)菌基本都是霉菌，主要有德氏根霉、黑曲霉、擬內(nèi)孢霉、米曲霉、臭曲霉、雪白根酶等。分為兩大類：一類稱為根霉型糖化酶(它對(duì)淀粉的水解率為100％)。另一類稱為黑曲霉型糖化酶(它對(duì)淀粉的水解率為80％左右)。（二）糖化酶的最適pH為4～5，最適反應(yīng)溫度為50—60℃。第三十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

二、糖化酶產(chǎn)生菌的酶系組成霉菌產(chǎn)生的淀粉酶是一種復(fù)合酶，生產(chǎn)糖化酶的菌種(霉菌)同時(shí)也生產(chǎn)α—淀粉酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，這三種酶的比例因菌種不同而異，亦會(huì)受營(yíng)養(yǎng)條件，培養(yǎng)條件的變化而變化。（一）米曲霉以產(chǎn)α—淀粉酶為主，生產(chǎn)糖化酶、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶較少。（二）黑曲霉以產(chǎn)糖化酶為主，葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶較強(qiáng)，α—淀粉酶較弱。（三）德氏根霉以產(chǎn)糖化酶為主，α—淀粉酶較強(qiáng)，不產(chǎn)葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶。第三十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日三、糖化酶的工業(yè)生產(chǎn)我國(guó)用液體深層發(fā)酵法由黑曲霉生產(chǎn)糖化酶始于1965年，1977年中科院微生物所選育出黑曲霉突變菌株UV-11，產(chǎn)酶活力增加到6000U/ml，此后又以UV-11為出發(fā)菌株進(jìn)行選育，得到多株產(chǎn)酶達(dá)10000U/ml的菌株，1995年我國(guó)糖化酶產(chǎn)量達(dá)14萬(wàn)噸，占全國(guó)酶制劑總產(chǎn)量的60％。第四十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日(一)黑曲霉液體深層培養(yǎng)法生產(chǎn)糖化酶第四十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日(二)根霉固態(tài)培養(yǎng)法生產(chǎn)糖化酶第四十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日四、去除葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的方法1．凋節(jié)pH法2．吸附法3．表面活性劑處理4．雜多酸或高分子共聚物沉淀法5．氯仿沉淀法6．陽(yáng)離子交換樹脂處理第四十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)脫支酶(DebranchingEnzyme)脫支酶是專一性水解支鏈淀粉或糖原的α—1．6糖苷鍵，從而將側(cè)枝切下形成長(zhǎng)短不一的直鏈糊精的一類酶。根據(jù)對(duì)底物的專一性，可將脫支酶分為支鏈淀粉酶(普魯蘭酶)和異淀粉酶兩類。第四十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8