第十二章 胚胎工程

第12章胚胎工程提要胚胎工程的理論基礎(chǔ)：胚胎發(fā)育胚胎工程的主要操作對(duì)象：生殖細(xì)胞、受精卵、早期胚胎細(xì)胞。胚胎工程的研究?jī)?nèi)容：體外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎冷凍保存、動(dòng)物性別控制。一、胚胎發(fā)育（一）、發(fā)育

個(gè)體發(fā)育（ontogeny）：自受精卵開始到形成成熟個(gè)體所經(jīng)歷的一段過(guò)程。發(fā)育

系統(tǒng)發(fā)育（phylogeny）：同一起源的生物群的形成歷史。（二）、胚胎發(fā)育的基本過(guò)程受精卵裂囊胚的形成原腸腔的形成中胚層及體腔形成胚層分化1、受精1.1精子和卵子的產(chǎn)生第一次減數(shù)分裂前期青春期后第二次減數(shù)分裂中期卵子的成熟原始卵泡次級(jí)卵泡初級(jí)卵泡成熟卵泡次級(jí)卵泡1.2精子和卵子的結(jié)構(gòu)精子的結(jié)構(gòu)卵子的結(jié)構(gòu)圖1.3受精即：精子與卵子融合成受精卵的過(guò)程。主要包括以下幾個(gè)過(guò)程：精子的獲能（capacitation）、頂體反應(yīng)（acrosomereaction）、皮層反應(yīng)（corticalreaction）、原核形成和融合受精的早期事件引自JaniceP.Evans2002

精子的獲能剛排出的精子雖有運(yùn)動(dòng)能力，但不能穿過(guò)卵子的放射冠和透明帶，只有接受雌性生殖道的分泌物（獲能因子），才具有受精能力，這種作用稱為精子獲能。在體外條件下，血清白蛋白（serumalbumin）、高密脂蛋白（high-densitylipoproteins）、氨基聚糖（glycosaminoglycans）、孕酮、鈣離子載體（A23187）、ZP3、CO2等均可促進(jìn)精子獲能。頂體酶原轉(zhuǎn)化為有活性的頂體酶。頂體反應(yīng)獲能的精子首先借助頭后部（頂體后區(qū)）透明質(zhì)酸酶活性穿過(guò)卵母細(xì)胞外卵丘細(xì)胞層（放射冠），到達(dá)透明帶，然后精子通過(guò)頭前部（頂體區(qū)）質(zhì)膜表面的ZP結(jié)合蛋白與卵母細(xì)胞透明帶發(fā)生識(shí)別，完成結(jié)合過(guò)程，誘發(fā)頂體反應(yīng)，即：頂體以外排的方式釋放出水解酶，將卵子的透明帶和卵黃膜溶解，形成精子穿過(guò)的通道

皮層反應(yīng)精子進(jìn)入卵子后，在精子接觸點(diǎn)上，磷脂酰肌醇信號(hào)途徑啟動(dòng)，產(chǎn)生DAG和IP3。IP3導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子釋放鈣信號(hào)進(jìn)而引起皮層反應(yīng)，即：卵細(xì)胞膜下的皮層顆粒（內(nèi)含酶類的囊泡），以外排的方式，進(jìn)入卵黃膜和卵膜之間的腔隙，酶類引起透明帶“硬化”，形成受精膜。多精受精阻斷受精后通過(guò)兩種機(jī)制阻止多精進(jìn)入，一是膜瞬間去極化；二是通過(guò)皮層反應(yīng)，破壞精子受體和形成受精膜。

多精進(jìn)入會(huì)形成多余的分裂極和紡錘體，導(dǎo)致細(xì)胞異常分裂而使胚胎發(fā)育終止。原核形成精子的刺激使處于休眠狀態(tài)的卵子被激活，重新回到減數(shù)分裂階段，迅速完成第二次分裂，釋放極體。此時(shí)精子和卵子的細(xì)胞核分別稱為雄原核（malepronucleus）和雌原核（female

pronucleus）。融合兩個(gè)原核逐漸在細(xì)胞中部靠攏，核膜隨即消失，染色體混合，形成二倍體的受精卵（fertilizedovum）又稱合子（zygote）。2、卵裂卵裂（cleavage）是指受精卵經(jīng)過(guò)分裂，將卵質(zhì)分配到子細(xì)胞的過(guò)程，分裂產(chǎn)生的細(xì)胞叫做分裂球(blastomere)。哺乳動(dòng)物的卵裂較慢，受精1天后才開始卵裂，8細(xì)胞之前，分裂球之間結(jié)合比較松散，8細(xì)胞之后突然緊密化（compaction），在64細(xì)胞以前為實(shí)心體，稱為桑椹胚。3、囊胚的形成在128細(xì)胞階段，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部空隙擴(kuò)大，成為充滿液體的囊胚腔（blastocoel），此時(shí)的胚胎稱為囊胚，或是胚泡。3、原腸胚蛙；外包法+內(nèi)移法；海膽文昌魚5、胚層分化

外胚層形成神經(jīng)系統(tǒng)、表皮、皮膚腺、毛發(fā)、指甲、爪和牙齒等；

中胚層形成骨骼、肌肉、泌尿生殖系統(tǒng)、淋巴組織、結(jié)締組織、血液；

內(nèi)胚層形成呼吸系統(tǒng)、消化道、肝、胰。二、體外受精（一）、體外受精概述

體外受精(InVitroFertilization)是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過(guò)程的技術(shù)，英文簡(jiǎn)稱為IVF。由于它與胚胎移植技術(shù)(ET)密不可分，又簡(jiǎn)稱為IVF-ET。在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動(dòng)物稱試管動(dòng)物(test-tubeanimal)。（二）、體外受精技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史1878年，德國(guó)人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動(dòng)物的體外受精技術(shù)。1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞人Austin同時(shí)發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的精子獲能現(xiàn)象，這一領(lǐng)域的研究才獲得突破性進(jìn)展。

1959年，張明覺以家兔為實(shí)驗(yàn)材料，從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)，從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子，精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過(guò)程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體的輸卵管中，其中4只妊娠，并產(chǎn)下15只健康仔兔，這是世界上首批試管動(dòng)物，它們的正常發(fā)育標(biāo)志著體外受精技術(shù)的建立。試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)、嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)等相繼出生。目前，采用IVF-ET技術(shù)，充分利用良種母牛的遺傳資源，不僅應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，也成為研究其他胚胎生物技術(shù)，如克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)和性別控制等的重要輔助手段。

試管嬰兒人類第一例試管嬰兒子1978年7月23日誕生在英國(guó)，嬰兒名叫路易斯布朗。她的母親由于輸卵管堵塞不能生育。中國(guó)第一個(gè)試管嬰兒于1985年4月在臺(tái)灣誕生；我國(guó)大陸的第一位的試管嬰兒于1988年3月在北京醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院誕生。愛德華茲——試管嬰兒之父、劍橋大學(xué)名譽(yù)教授、英國(guó)皇家學(xué)會(huì)會(huì)員、2001年拉斯克臨床醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主。他將獨(dú)享1000萬(wàn)瑞典克朗(約146萬(wàn)美元)的獎(jiǎng)金——主要是因?yàn)榱硪幻匾暮献髡?，婦科醫(yī)生帕特里克·斯特普托(PatrickSteptoe)早在1988年便撒手人寰。

1、試管嬰兒技術(shù)包括哪些技術(shù)？體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植技術(shù)。2.試管嬰兒和母親正常懷孕，生產(chǎn)的過(guò)程有何異同？相同之處：都通過(guò)有性生殖產(chǎn)生，在母體子宮內(nèi)發(fā)育形成胎兒。不同之處：受精作用在體外，并在體外發(fā)育成早期胚胎進(jìn)行胚胎移植。（三）、體外受精技術(shù)的研究意義體外受精技術(shù)對(duì)動(dòng)物生殖機(jī)理研究、畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)和瀕危動(dòng)物保護(hù)等具有重要意義。在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效的手段，對(duì)充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價(jià)值。在人類，IVF-ET技術(shù)是治療某些不孕癥的重要措施之一。國(guó)產(chǎn)奶牛：年均產(chǎn)奶量3000公斤左右國(guó)際良種奶牛：年均產(chǎn)奶量10000公斤左右引進(jìn)一頭良種成年奶牛需要3萬(wàn)－5萬(wàn)元；牛的生育率低，一頭牛1胎只生1只，一生只能生育4~5次。牛的生育率雖然很低，但是牛的卵母細(xì)胞卻相當(dāng)?shù)亩?，其卵巢中卵母?xì)胞數(shù)目要比一生中排卵數(shù)多1000倍左右；公牛產(chǎn)生的精子數(shù)目就更多了。胚胎移植采集良種母牛的卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)采集良種公牛精子精子體外獲能體外受精良種牛體外受精胚胎受體牛良種犢牛成熟期牛屠宰加工廠市場(chǎng)采集卵巢中的卵母細(xì)胞“試管?！惫S化生產(chǎn)的技術(shù)流程圖（四）、體外受精技術(shù)的基本操作程序1、卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)1.1卵母細(xì)胞的采集：采集方法通常有三種。

(1)超數(shù)排卵：雌性動(dòng)物用促卵泡素和促黃體素處理，促使卵巢排出更多的卵子，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等大家畜中，由于操作程序復(fù)雜，成本較高，很少使用。(2)從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。按照目前的技術(shù)水平，一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。

(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢，經(jīng)洗滌、保溫（30℃~37℃)后，快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細(xì)胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對(duì)卵巢進(jìn)行切片，收集卵母細(xì)胞。1.2母細(xì)胞的選擇：采集的COC要求卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細(xì)胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中，常把未成熟卵母細(xì)胞分為A、B、C和D四個(gè)等級(jí)。在體外受精實(shí)踐中，一般只培養(yǎng)A級(jí)和B級(jí)卵母細(xì)胞。

1.3卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：家畜卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。2、體外受精2.1精子的獲能處理體內(nèi)獲能：直接從交配母畜的子宮內(nèi)取精子體外受精：先洗滌篩選，然后用肝素和鈣離子載體等藥物誘發(fā)精子獲能。2.2受精：（1）獲能精子與成熟卵子的共培養(yǎng)，（2）顯微注射受精

顯微注射受精(microinsemination)又稱輔助受精技術(shù)(Techniquesf.rassistedfertilizati.n)，克服在某些情況下精子不能穿過(guò)透明帶和卵黃膜的缺陷。透明帶下注射法方法卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射法應(yīng)用價(jià)值在醫(yī)學(xué)上已成為治療某些男性不育癥的主要措施之一；在基礎(chǔ)生物學(xué)中，它對(duì)研究哺乳動(dòng)物受精和發(fā)育機(jī)理有很重要的價(jià)值；對(duì)挽救瀕危動(dòng)物和充分利用優(yōu)良種公畜等有重要意義3、早期胚胎體外培養(yǎng)受精卵需移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育潛力（一般要發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段），質(zhì)量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成熟或進(jìn)行冷凍保存。

發(fā)育阻滯（developmentalblock）體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育過(guò)程中，常會(huì)停在某一階段不再發(fā)育，此現(xiàn)象稱發(fā)育阻滯。產(chǎn)生因素：受精卵早期發(fā)育受母源性基因的調(diào)控，到2細(xì)胞之后，自身基因啟動(dòng)時(shí)，母源性的mRNA失活，此期胚胎對(duì)環(huán)境超敏感；胚胎基因激活的細(xì)胞內(nèi)[H2O2]的升高，體外培養(yǎng)條件不能及時(shí)清除，使得胚胎發(fā)育阻滯?？朔铚F(xiàn)象的方法：改進(jìn)培養(yǎng)液成分，改善培養(yǎng)條件，減少對(duì)胚胎發(fā)育不利的成分體細(xì)胞共培養(yǎng)(輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)），以提供發(fā)育所需的物質(zhì)條件(（五）、體外受精技術(shù)存在的問題和發(fā)展方向

1、存在的問題

(1)囊胚發(fā)育率低，細(xì)胞數(shù)少。體外受精卵在培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在發(fā)育阻斷(developmentalblock)(2)產(chǎn)犢率低2、發(fā)展方向(1)深入研究卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的分子機(jī)理(2)提高取卵率、加強(qiáng)腔前卵泡培養(yǎng)的研究。(3)加強(qiáng)體外受精與其他生物技術(shù)的結(jié)合。

三、胚胎移植胚胎移植又稱受精卵移植，就是將1頭母畜(供體)的受精卵移植到另一頭母畜(受體)的子宮內(nèi)，使之正常發(fā)育成為新個(gè)體的技術(shù)，俗稱“借腹懷胎”。胚胎移植實(shí)際上就是產(chǎn)生胚胎的供體和養(yǎng)育胚胎的受體分工合作共同繁殖后代。（一）、胚胎移植的研究歷史1、1890年，劍橋大學(xué)的Heape以兔為材料，首次獲得胚胎移植的成功，奠定了胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)和原則。2、20世紀(jì)30～70年代成為生物科學(xué)的主要研究方向之一，在多種家畜上移植成功。3、1971年世界上出現(xiàn)了第一個(gè)胚胎移植公司4、1974年國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)(IETS)成立

5、目前，胚胎移植已成為畜牧業(yè)中最活躍的產(chǎn)業(yè)。在商業(yè)化應(yīng)用上，牛的胚胎移植開始最早，商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用較為成熟，占的比例也最大羊的胚胎移植應(yīng)用最先開始于澳大利亞，20世紀(jì)70年代，澳大利亞每年要進(jìn)口300萬(wàn)美元的馬海毛（安哥拉山羊毛），從而使安哥拉山羊處于一種不切實(shí)際的高價(jià)地位，為胚胎移植提供了市場(chǎng)條件，促進(jìn)了澳大利亞安哥拉山羊胚胎移植的發(fā)展和應(yīng)用。我國(guó)牛、羊胚胎移植的發(fā)展過(guò)程分為三個(gè)階段：試驗(yàn)研究階段（20世紀(jì)70年代初至80年代中）發(fā)展提高階段（20世紀(jì)80年代中至90年代中）推廣應(yīng)用階段（20世紀(jì)90年代中至現(xiàn)在）奶牛、肉牛、安哥拉山羊、波爾山羊和良種綿羊的胚胎移植開始在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用2000年全國(guó)奶牛胚胎移植數(shù)量達(dá)到5000頭2002起，農(nóng)業(yè)部在北京、新疆、黑龍江、內(nèi)蒙古、寧夏、陜西、山西、河北和山東等9?。▍^(qū)）實(shí)施“萬(wàn)枚高產(chǎn)奶牛胚胎移植富民工程”，極大地促進(jìn)了奶牛胚胎移植的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，使我國(guó)奶牛胚胎移植數(shù)量突破10000頭2003年我國(guó)共生產(chǎn)奶、肉牛胚胎30000枚以上(二)胚胎移植的意義1、充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，大大加速了良種母畜的建立和擴(kuò)大。2、誘發(fā)肉畜產(chǎn)雙胎，提高生產(chǎn)效率。對(duì)發(fā)情的母畜配種后再移植一個(gè)胚胎到排卵對(duì)側(cè)子宮角內(nèi)。據(jù)報(bào)道，這樣處理后的受胎率可高達(dá)70%以上，雙胎率可達(dá)40-60%。另有報(bào)道，當(dāng)向每一側(cè)子宮角移植一個(gè)胚胎時(shí)，有72%的母牛受胎，其中雙胎率可達(dá)到73%。3、縮短世代間隔，增加選擇強(qiáng)度，也可以減少種畜的引進(jìn)和保存品種資源等。加速了良種母畜的建立和擴(kuò)大

(三)、胚胎移植的生理基礎(chǔ)1、母牛發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育在發(fā)情后的最初一段時(shí)期，不論是否已受精，母牛生殖系統(tǒng)均處于受精后的生理狀態(tài)，在生理現(xiàn)象上，妊娠與未孕并無(wú)區(qū)別。2、早期胚胎的游離狀態(tài)胚胎在發(fā)育早期有相當(dāng)一段時(shí)間(附植之前)是獨(dú)立存在的，它的發(fā)育基本上靠本身貯存的養(yǎng)分，還未和子宮建立實(shí)質(zhì)性聯(lián)系。3、在同一物種之內(nèi)，并沒有免疫排斥現(xiàn)象。4、移植的胚胎，在一定時(shí)期會(huì)和受體子宮內(nèi)膜建立生理上和組織上的聯(lián)系，保證了以后的正常發(fā)育。此外，受體并不會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生遺傳上的影響。

(四)、胚胎移植的操作原則1、胚胎移植前后所處環(huán)境的一致性2、胚胎收集期限牛一般受精后3-8天采集3、在全部操作過(guò)程中，胚胎不應(yīng)受到任何不良因素(物理的、化學(xué)的、微生物的)的影響而危及生命力。4、移植的胚胎必須經(jīng)鑒定并認(rèn)為是發(fā)育正常者。

選擇供體母牛受體母?！诎l(fā)情處理……超數(shù)排卵供體公牛配種沖卵質(zhì)量檢查、培養(yǎng)胚胎移植妊娠檢查分娩（胚胎移植的犢牛）(五).胚胎移植的基本程序1、供體、受體的選擇供體是要加速繁殖的、有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的、健康的優(yōu)良畜種。受體是繁殖力強(qiáng)的健康本地種。3、同步發(fā)情處理即：利用某些激素制劑人為的控制和調(diào)整一群母畜的發(fā)情周期，使之在預(yù)定時(shí)間內(nèi)發(fā)情。同期發(fā)情技術(shù)就是以卵巢和垂體分泌的某些激素在母畜發(fā)情周期中的作用作為理論依據(jù)用激素制劑和類似物，有意識(shí)地干預(yù)某些母畜的發(fā)情過(guò)程，暫時(shí)打亂它們的自然發(fā)情周期的規(guī)律，繼而將發(fā)情周期的進(jìn)程調(diào)整到統(tǒng)一的步調(diào)之內(nèi)，人為地造成發(fā)情同期化。

添加孕酮等孕激素延長(zhǎng)抑制卵泡發(fā)育，延長(zhǎng)黃體期；添加前列腺素類

溶解黃體使得發(fā)情期提前到來(lái)，有時(shí)為了使同期發(fā)情同期排卵更有效，以便提高受胎率，而采取的配套的促性腺激素，如孕馬血激素、

絨毛膜激素、促卵泡素，促黃體素及促性腺激素釋放激素，它可促進(jìn)

內(nèi)源促性腺激素的釋放。

母牛的發(fā)情周期

黃體期卵泡期周期第18至第21天周期第1至第17天4、采卵即：胚胎回收

手術(shù)法：按外科剖腹術(shù)的要求進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備收集胚胎的方法非手術(shù)法：采卵一般在輸精后5-7天進(jìn)行?？刹捎枚穼?dǎo)管的沖卵器5、胚胎檢查

(1)檢卵將收集的沖卵液于37℃溫箱內(nèi)靜置10-15min。胚胎沉底后，移去上層液。取底部少量液體移至平皿內(nèi)，靜置后，鏡檢。低倍(10-20倍)下檢查胚胎數(shù)量，高倍(50-100倍)下觀察胚胎質(zhì)量。(2)吸卵可用1毫升的注射器裝上特別的吸頭進(jìn)行吸卵。要求目標(biāo)準(zhǔn)確，速度快，帶液量少，無(wú)丟失。目的是移取、清洗、處理胚胎，(3)胚胎質(zhì)量鑒定正常發(fā)育的胚胎，細(xì)胞(卵裂球)外形整齊，大小一致，分布均勻，外膜完整。無(wú)卵裂現(xiàn)象(未受精)和異常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。不同動(dòng)物胚胎移植時(shí)間不同牛、羊：桑椹胚或囊胚階段小鼠、家兔：卵裂期或囊胚階段試管嬰兒：8個(gè)或16個(gè)細(xì)胞階段

6.胚胎培養(yǎng)發(fā)育到適宜階段時(shí)，可將其取出向受體移植或冷凍保存。對(duì)供體和受體于術(shù)后要注意觀察是否發(fā)情。供體發(fā)情時(shí)即可正常配種，或經(jīng)過(guò)40-80天再重復(fù)作為供體。胚胎移植的成功率，即受體妊娠率，鮮胚移植達(dá)60-70%，凍胚也達(dá)到45-50%，半胚移植達(dá)55.6%。超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中到底有多大的意義呢？超數(shù)排卵與胚胎移植技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，仍然有幾個(gè)基礎(chǔ)問題需要進(jìn)行深入研究：研究控制卵泡發(fā)育動(dòng)態(tài)的原理和方法，進(jìn)一步縮小超數(shù)排卵的個(gè)體差異、提高超排穩(wěn)定性，提高胚胎移植在家畜品種改良和育種中的應(yīng)用效率在胚胎移植工作中，后代數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于預(yù)期數(shù)。這里面肯定存在著從卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)成熟及早期胚胎發(fā)育的內(nèi)在原因，但到底是什么原因，這是我們需要進(jìn)一步探索清楚的問題。供體母畜各個(gè)體之間所獲得的胚胎移植效果存在著較大的差異(P<0.05)，

四、胚胎分割技術(shù)胚胎分割技術(shù)就是將一枚胚胎用顯微手術(shù)方法分割成二分、四分、八分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，得到同卵雙生或多生后代的技術(shù)。是胚胎克隆的一種方法。胚胎分割技術(shù)研究的理論根據(jù)是動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞具有全能性。1979年，英國(guó)一位科學(xué)家利用綿羊的幼胎進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)綿羊的受精卵從1個(gè)分裂為8個(gè)細(xì)胞時(shí)，他把這8個(gè)細(xì)胞分成4份，每份2個(gè)細(xì)胞，然后將分割的細(xì)胞重新送到母羊子宮里孕育。結(jié)果，母羊產(chǎn)下了4頭活潑健康的小羊羔。1986年我國(guó)科學(xué)家曾用綿羊作試驗(yàn)，把一高產(chǎn)綿羊的胚胎分成5份，分別移植在4頭普通的發(fā)情母羊子宮內(nèi)培育，結(jié)果得到5頭小羊羔。

胚胎分割、移植技術(shù)對(duì)提高動(dòng)物繁殖率的效果是極其顯著的。如在正常情況下，一頭良種奶牛一生產(chǎn)仔只是10頭左右，如采用胚胎分割、移植技術(shù)，這奶牛就能得到幾百頭良種奶牛。受精卵分割半胚徒手切割

五、胚胎的保存

（一）、胚胎保存原因?qū)μ囟ǖ墓w而言，能夠獲得的胚胎數(shù)是不可預(yù)測(cè)的室溫或體溫條件下，在特定培養(yǎng)液中胚胎只能存活10-20小時(shí)(牛羊移植用的鮮胚要在4-8小時(shí)進(jìn)行）。（二）、胚胎保存的意義

1、可以免去移植時(shí)要求的同期發(fā)情處理。2、可以不受時(shí)間、地點(diǎn)和選定受體母牛的限制，隨時(shí)隨地可以進(jìn)行胚胎移植。

（三）、胚胎的保存方法1972年Whittinghan等發(fā)現(xiàn)了在-196℃下保存2～8細(xì)胞期小鼠胚胎的冷凍技術(shù)。常規(guī)速冷凍法冷凍保存方法一步冷凍法玻璃化法常采用多種抗凍保護(hù)劑。六、動(dòng)物性別控制（一）、動(dòng)物性別控制（sexcontrol）指通過(guò)人為的手段進(jìn)行干預(yù)，使動(dòng)物按人們的意愿繁殖出特定性別后代的技術(shù)。

動(dòng)物的性別由什么決定呢？在二倍體動(dòng)物的體細(xì)胞中,都有一對(duì)與性別決定有明顯而直接關(guān)系的染色體叫性染色體。1902年Mcclung研究蝗蟲時(shí)，在歷史上首次提出了性別決定的染色體理論。（二）理論基礎(chǔ)

動(dòng)物的性染色體分為兩類：XY型雄性中是一對(duì)大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)不同的性染色體，大的一條叫X染色體,小的一條叫Y染色體，即：XY型。雌性的體細(xì)胞中是一對(duì)X染色體，即：XX型。稱為雄異配型。大部分動(dòng)物屬于此類型。ZW型是雌異配型，主要是鳥類和極少數(shù)昆蟲。在XY型染色體中，精子有兩種類型，一是含有X染色體的精子，另一個(gè)是含有Y染色體的精子。在哺乳動(dòng)物中，含X染色體精子受精后生產(chǎn)出雌體，含Y染色體精子受精后生產(chǎn)出雄體。

（三）、性別控制的方法與技術(shù)1、X、Y精子分離法(受精之前干預(yù)）

2、早期胚胎性別鑒定(受精之后干預(yù)）

3、激素和環(huán)境

1、X、Y精子分離法1.1理論依據(jù)：X、Y精子的差別Y精子有F小體即Y染色體長(zhǎng)臂末端有比其他部分強(qiáng)的熒光亮點(diǎn)精子的重量X染色體的DNA含量比Y染色體的多，所以在液體中運(yùn)動(dòng)力和沉降速度不同。？精子的運(yùn)動(dòng)Y精子的運(yùn)動(dòng)活力比較強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)速度快精子的耐酸堿性Y精子喜堿性，X精子喜酸性精子表面抗原Y精子表面有H-Y抗原（雄性特異性次要組織相容性抗原）1.2分離方法（1）沉降法

利用一定的密度、粘度、pH值、滲透壓并且在有營(yíng)養(yǎng)的液體中對(duì)精液沉降分離，用層次沉淀達(dá)到分離目的。上層主要為Y精子，下層主要為x精子（2）離心法

這種方法主要是依據(jù)精子的比重關(guān)系來(lái)分離精子。以上兩種方法有一定效果其結(jié)果都不穩(wěn)定（3）電泳法

利用X，Y精子所帶生物點(diǎn)不同，采用電泳法對(duì)精子進(jìn)行分離，分別收集向陽(yáng)極和陰極移動(dòng)的精子。大量實(shí)驗(yàn)表明，陽(yáng)極方向多為X精子，陰極方向多為Y精子（4）流式細(xì)胞分離法

主要依據(jù)是X、Y精子DNA的含量不同。

(5)免疫學(xué)方法目前國(guó)內(nèi)外對(duì)H—Y克隆抗體都有廣泛的研究，可以期望未來(lái)免疫學(xué)方法能在控制性別上得到應(yīng)用（6）改變調(diào)控受精環(huán)境（牛的性控常用方法）調(diào)節(jié)生殖道PH值

有人在人工授精時(shí)用化學(xué)試劑改變陰道里pH值（精氨酸，蘇打水等沖洗），從而控制動(dòng)物后代性別比例。控制輸精時(shí)間該方法應(yīng)用關(guān)鍵是如何準(zhǔn)確判斷發(fā)情和確定何時(shí)排卵。先排卵再輸精，產(chǎn)雄性的幾率高，反之，則雌性的幾率高。冷凍精液（奶牛生產(chǎn)常用方法）Y精子由于活動(dòng)力強(qiáng)，存活時(shí)間短，冷凍后在復(fù)蘇活力大減，