第三章 細胞生物學(xué)研究方法

細胞生物學(xué)CellBiology課件制作與講授:楊谷良Theanalyseofacell’scontents二

細胞組分分析方法2細胞組分的分析方法2.1離心技術(shù)Centrifugation?是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。?轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。?轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。?目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達10萬r/min，離心力超過500Kg。48離心分離技術(shù)

不同的細胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。常用的兩類離心分離方法是速度離心(velocitycentrifugation)和等密度離心(isodensitycentrifugation)

49蔗糖或者甘油(它們的最大密度是1.3g/cm3)通?？捎糜诜蛛x膜結(jié)合的細胞器，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和線粒體。

離心分離密度大于1.3g/cm3的樣品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介質(zhì)。重金屬鹽氯化銫(CsCl)是目前使用的最好的離心介質(zhì)，它在離心場中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定。在氯化銫形成的密度梯度中，離心管頂部的密度為:1.65g/cm3，底部為:1.75g/cm3。因為DNA的密度是1.70g/cm3，會停留在離心管的中部)。

50不同的細胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

51差速離心(differentialcentrifugation)

主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的

52等密度離心離心適當時間，樣品中的顆粒向管底部移動，由于體積的不同，移動的區(qū)帶速度不同。常用的介質(zhì)有蔗糖、多聚蔗糖、氯化銫等

53介質(zhì)需要具有以下特點：密度逐漸增加高溶解性惰性物質(zhì)14蔗糖密度梯度離心：用于分離密度相近而大小不同的組分。

CsCl密度梯度離心重金屬鹽氯化銫(CsCl)在離心場中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定，用于分離不同密度的細胞組分。54層析分離技術(shù)(chromatography)

層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的物理分離方法。目前最常用的層析方法有凝膠過濾層析離子交換層析親和層析等55凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)

又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行分離和純化

56親和層析(affinitychromatography)

當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開

57離子交換層析(ion-exchangechromatography)

不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點，在一定的條件下解離后所帶的電荷種類和電荷量都不同，因而可與不同的離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附。582.2細胞組分的顯示方法59一些顯色劑可以與所要檢測物的特殊基團特異結(jié)合，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷物質(zhì)的分布情況和相對含量。DNA—福爾根反應(yīng)：酸水解去除RNA及DNA上的嘌呤，使醛基暴露出來，暴露的醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。脂肪滴—四氧化餓與脂肪酸反應(yīng)呈黑色蛋白質(zhì)—米倫反應(yīng)：氮汞試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈酪氨酸殘基反應(yīng)呈紅色。蛋白質(zhì)—重氮反應(yīng)：氫氧化重氮與酷氨酸、色氨酸、組氨酸反應(yīng)形成有色復(fù)合物，2.1離心技術(shù)2細胞組分的分析方法2.2顯示方法2.3細胞免疫化學(xué)?根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。常用的標記物有熒光素和酶。?免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。?酶標免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：用酶代替熒光素與抗體耦聯(lián)，常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。60?免疫電鏡技術(shù)：將抗體進行特殊標記后用電子顯微鏡觀察免疫反應(yīng)的結(jié)果》免疫鐵蛋白技術(shù)》免疫酶標技術(shù)》免疫膠體金技術(shù)?應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。61利用免疫膠體金技術(shù)標記核骨架622細胞組分的分析方法2.4分子生物學(xué)方法

?包括基因重組技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移、分子雜交、PCR反應(yīng)、序列分析等等

63基因工程技術(shù)(geneengineering)

基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段

6465選擇性基因敲除(geneknockout)

是指一個有功能的基因通過基因工程方法完全被剔除的人工突變技術(shù)。人為的將小鼠的某一種有功能的基因完全缺失的技術(shù)就稱為基因敲除技術(shù)。應(yīng)用于幾種遺傳病的研究，還可用于研究特定基因的細胞生物學(xué)活性以及研究發(fā)育調(diào)控的基因作用等

66轉(zhuǎn)基因敲除小鼠的獲得

672.4分子雜交技術(shù)（一）原位雜交insituhybridization

（二）Southern雜交

?是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。?

將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。682.1離心技術(shù)2細胞組分的分析方法2.2顯示方法2.3細胞免疫化學(xué)2.4分子雜交技術(shù)2.5放射自顯影技術(shù)放射自顯影術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。692.5放射自顯影技術(shù)原理：將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。實驗室一般常選用14C和3H標記。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR）來顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，研究多糖則用3H甘露糖、3H巖藻糖等。702細胞組分的分析方法2.6流式細胞儀71流式細胞儀Flowcytometer?用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。流式細胞計分選細胞示意圖

722.7分光光度技術(shù)：細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜能夠吸收，據(jù)此測定這些物質(zhì)在細胞內(nèi)的含量。如DNA最高吸收高峰在260nm。3.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程

細胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture）就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生長和生存的技術(shù)。733.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程3.1.1動物細胞培養(yǎng)74Primaryculture&Subculture

原代培養(yǎng)細胞，primaryculture,指直接從機體出后立即培養(yǎng)的細胞，通常把第1代至地10代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞。

傳代培養(yǎng)細胞，Subculture,指適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞。（又分為有限細胞系和連續(xù)細胞系）75群體培養(yǎng)&克隆培養(yǎng)群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

群體培養(yǎng)massculture：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層；克隆培養(yǎng)clonalculture：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。76基本定義1．

原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。原代培養(yǎng)的細胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長，需要從更換培養(yǎng)基。將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。2．

細胞株（cellstrain）：經(jīng)生物學(xué)鑒定，具有特殊生物學(xué)特性或者標記的細胞克隆。3．

細胞系（cellline）：在培養(yǎng)過程中，少數(shù)細胞可以持續(xù)傳代40-50次，并且依然保持原來染色體的二倍體水平以及接觸掏的行為的這類細胞。77有限細胞系：當傳代到50代以后不能再繼續(xù)傳下去的細胞系，因其傳代次數(shù)有限，稱為有限細胞系。5。連續(xù)細胞系：在持續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，部分細胞發(fā)生了遺傳突變，并且使其帶有癌細胞特點，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去的這種傳代細胞。6．

克?。╟lone）：亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。貼壁培養(yǎng)

分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘至幾小時)就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼壁后的細胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長，所以此法又叫單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細胞保持接觸抑制(contactinhibition)的特性。

783.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程3.1.1動物細胞培養(yǎng)3.1.2植物細胞培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點：–①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；–②便于進行細胞融合，形成雜交細胞；–③適宜條件下可產(chǎn)生細胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。79植物細胞培養(yǎng)80植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

將原生質(zhì)體放在合適的培養(yǎng)基上，經(jīng)過誘導(dǎo)分化可以重新長成植株。原生質(zhì)體也可用于植物細胞融合，

然后誘導(dǎo)形成新的植株。

81產(chǎn)業(yè)化的植物組織培養(yǎng)823.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程3.1.1動物細胞培養(yǎng)3.1.2植物細胞培養(yǎng)3.1.3非細胞體系Cellfreesystem,來源于細胞，而不具有完整的細胞結(jié)構(gòu)，但包含了進行正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)組成（如功能體系和酶反應(yīng)體系等）的體系即為非細胞體系。833.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程3.2細胞工程Cellengineering

通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cellfusion）或細胞雜交（cellhybridization）。3.2.1細胞融合誘導(dǎo)細胞融合的方法：生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。有性繁殖時發(fā)生的精卵結(jié)合是正常的細胞融合84Cellfusion?同核體homokaryon：相同基因型的細胞融合而成。?異核體heterokaryon：不同基因型的細胞融合而成。?融合核細胞synkaryon：通過細胞雜交形成的單核子細胞稱融合核細胞853.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程3.2細胞工程Cellengineering3.2.1細胞融合3.2.2單克隆抗體Monoclonalantibody?正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，Monoclonalantibody，獲1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎（M&P）。86單克隆抗體制備過程示意圖8713.1細胞培養(yǎng)3細胞培養(yǎng)與細胞工程3.2細胞工程Cellengineering3.2.1細胞融合3.2.2單克隆抗體Monoclonalantibody3.2.3顯微操作技術(shù)Micromanipulation,用顯微操作裝置對細胞進行解剖和顯微注射（microinjection）的技術(shù)。88顯微操作系統(tǒng)89利用顯微操作技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠90動物細胞核移植克隆技術(shù)

1997年，英國蘇格蘭羅斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通過細胞融合技術(shù)利用成年動物徹底分化的體細胞克隆出子代個體，開創(chuàng)了動物體細胞克隆的新時代。

細胞核移植克隆綿羊

91乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)乳腺生物反應(yīng)器是根據(jù)細胞生物學(xué)中蛋白質(zhì)合成與分選的機理，結(jié)合基因工程技術(shù)、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，利用動物的乳腺分泌某些具有重要價值的基因產(chǎn)物

92用轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)重要的醫(yī)用蛋白質(zhì)

93四、細胞及生物大分子的動態(tài)變化1熒光漂白恢復(fù)技術(shù)使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測所標記分子在活體細胞表面或細胞內(nèi)部運動及其遷移速率。FPR技術(shù)的原理是：利用高能激光照射細胞的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱熒光漂白（photobleaching）區(qū)。隨后，由于細胞質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運動，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移。結(jié)果使熒光漂白區(qū)的熒光強度逐漸地回復(fù)到原有水平。包括三個步驟：熒光染料與膜成分交聯(lián)；激光照射猝滅（漂白）膜上部分熒光；檢測猝滅部位熒光再現(xiàn)速率2、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)原理：兩種目的蛋白分別與兩種熒光蛋白[藍綠色熒光蛋白（CFP）的發(fā)射光譜與黃色熒光蛋白（YFP）]融合表達，由于兩種熒光蛋白的吸收光譜有相當?shù)闹丿B，當它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏。如果兩種蛋白沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射的熒光；但當?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是YFP的發(fā)射的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。應(yīng)用其它研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，諸如：酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標記等方法應(yīng)用的前提都是要破碎細胞或?qū)毎斐蓳p傷，無法做到在活細胞生理條件下實時的對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進行動態(tài)研究。

放射自顯影技術(shù)是用感光膠片測定細胞內(nèi)某種被放射性標記的物質(zhì)在細胞固定時所在的位置，基本過程如右圖所示。3、放射自顯影技術(shù)174、用于細胞生物學(xué)研究的模式生物模式生物：一些相對簡單的生物因為具有細胞數(shù)量少，分布相對單一，變化較好觀察等優(yōu)點。由于進化的原因，細胞生命在發(fā)育的基本模式方面具有相當大的同一性，所以利用位于生物復(fù)雜性階梯較低級位置上的物種來研究發(fā)育共通規(guī)律是可能的,尤其是當在有不同發(fā)育特點的生物中發(fā)現(xiàn)共同形態(tài)形成和變化特征時，發(fā)育的普遍原理也就得以建立。所以它們被稱為“模式生物”。常見的模式生物有:病毒、細菌、酵母、原生動物、黏菌、蛙、海膽、線蟲、果繩、斑馬魚、小鼠等．模式生物的特點:1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群；

2)容易獲得并易于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖；

3)容易進行實驗操作,特別是遺傳學(xué)分析。怎樣選擇一個合適的模式生物?1選擇的模式生物必須可以用來研究想要研究的問題，2盡量先選擇最簡單的一種。例:研究細胞凋亡的研究。只有多細胞生物才會進行凋亡，單細胞生物是不會的。那么單細胞生物就不能用來研究凋亡，理論上任何多細胞生物都可以。事實上細胞凋亡的研究使用的正是最簡單的多細胞模式生物：線蟲。該研究獲2002年Nobel生理醫(yī)學(xué)獎。４．１病毒（virus）特點：結(jié)構(gòu)簡單：基因組5-270kb，由少數(shù)蛋白質(zhì)殼體和遺傳物質(zhì)核酸組成．具有生命形式的兩重性細胞外形式與細胞內(nèi)形式必需進入細胞才能進行ＤＮＡ復(fù)制．應(yīng)用：１作為目的基因載體，使之連接到目的細胞染色體上．用來研究生物大分子相互作用，基因表達調(diào)控２腫瘤發(fā)生與防治．４．２細菌（Bacteria

）－大腸桿菌（Escherichiacoli）人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌。特點：只有一條環(huán)狀ＤＮＡ鏈，基因組序列測定完成（4.6*103bp）,約編碼4288個基因．培養(yǎng)方便，生長快，突變株誘變、分離與鑒定容易，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，基因定位簡單易行。應(yīng)用：基因表達調(diào)控、基因定位。4.3酵母（yeast）－單細胞真核生物的代表特點：個體小、培養(yǎng)方便、結(jié)構(gòu)簡單、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟；具有真核細胞的組織結(jié)構(gòu)：細胞核與各種細胞器。染色體結(jié)構(gòu)具有自主復(fù)制序列、著絲點序列、端粒序列。芽殖酵母（G1期很長），裂殖酵母（G2期很長）條件敏感型與人類基因同源應(yīng)用：細胞周期研究：芽殖，研究G1/S期轉(zhuǎn)換裂殖，研究G2/M期轉(zhuǎn)換。研究細胞分裂與周期調(diào)控許多基因與人類同源。4.4線蟲－秀麗隱桿線蟲（C.elegans）特點：基因組序列測定