四川理工學(xué)院酶1

第五章酶與生物催化劑酶的化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對其特異底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)。目前將生物催化劑分為兩類：酶、非酶生物催化劑（核酶，脫氧核酶等）1概述：酶的研究歷史酶的發(fā)現(xiàn)和提出：1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母汁成功實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵。提出了發(fā)酵與活細(xì)胞無關(guān)，而與細(xì)胞液中的酶有關(guān)。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促動力學(xué)原理—米氏學(xué)說。1926年，Sumner從刀豆種子中分離、純化得到了(Urease)脲酶結(jié)晶，首次證明酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)。1978年，Cech對四膜蟲的研究中發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用。1995年，JackW.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。2

5.1酶的概念及作用特點(diǎn)生物催化劑（Biocatalysts）：活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的生物大分子（包括酶和核酶）。酶(Enzyme）：是活細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有催化功能的蛋白質(zhì)。其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。核酶（Ribozyme）：具有催化功能的核酸分子。其化學(xué)本質(zhì)是核酸。酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)(Enzymaticreaction)。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物(Substrate)。5.1.1酶（Enzyme）的概念3

5.1.2酶的作用特點(diǎn)（一）酶和一般催化劑的共性①用量少而催化效率高；②它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。酶本身在反應(yīng)前后也不發(fā)生變化。③酶能夠穩(wěn)定底物形成的過渡狀態(tài)，降低反應(yīng)的活化能(Ea)，從而加速反應(yīng)的進(jìn)行。4

1．高效性（酶具有極高的催化效率）

酶的催化作用可使反應(yīng)速度提高10７–101３倍。例如：過氧化氫(Catalase)分解2H2O2

2H2O+O2

用Fe3+

催化，效率為6×10-4mol/S用Catalase催化，效率為6×106mol/S轉(zhuǎn)換數(shù)（Turnovernumber）的概念：每秒鐘每個酶分子能催化底物發(fā)生變化的微摩爾數(shù)，用kcat表示（mol/S）。-淀粉酶催化淀粉水解，1克結(jié)晶酶在65C條件下可催化2噸淀粉水解。（二）酶作為生物催化劑的特性5酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高108～1020倍，比一般催化劑高107～1013倍。酶加速反應(yīng)的機(jī)理是降低反應(yīng)的活化能(activationenergy)?；罨肿铀哂械母叱銎骄降哪芰糠Q為活化能6反應(yīng)總能量改變非催化反應(yīng)活化能酶促反應(yīng)活化能一般催化劑催化反應(yīng)的活化能能量反應(yīng)過程底物產(chǎn)物酶促反應(yīng)活化能的改變活化能：底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。7過氧化氫分解反應(yīng)所需活化能

催化劑每摩爾需活化能無18000cal膠態(tài)鈀11700cal過氧化氫酶2000cal82．具有高度專一性(HighSpecificity),又稱為特異性指酶在催化生化反應(yīng)時對底物的選擇性，即一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)。亦即酶只能催化某一類或某一種化學(xué)反應(yīng)。

絕對特異性(absolutespecificity)相對特異性(relativespecificity)立體結(jié)構(gòu)特異性(stereo

specificity)9絕對特異性酶只作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物

。如：10相對特異性酶作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。如：11立體結(jié)構(gòu)特異性酶僅作用于立體異構(gòu)體中的一種。乳酸脫氫酶只作用于L-乳酸，而對D-乳酸沒有作用123．反應(yīng)條件溫和酶促反應(yīng)一般在pH5-8水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度范圍為20-40C。高溫或其它苛刻的物理或化學(xué)條件，將引起酶的失活４．酶易失活凡能使蛋白質(zhì)變性的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等條件都能使酶破壞而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比較溫和的條件如常溫、常壓和接近中性的酸鹼度。13５.酶活力可調(diào)節(jié)控制如抑制劑調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。

６.某些酶催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。如乙醇脫氫酶(NAD為輔酶)

NAD：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸14

酶作為生物催化劑的特性1．高效性2．專一性3．反應(yīng)條件溫和４．酶易失活５.酶活力可調(diào)節(jié)控制６.某些酶催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。小結(jié)155.2酶的命名及分類(1)習(xí)慣命名法:根據(jù)酶催化底物來命名（Proteinase,Amylase）根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名（水解酶；轉(zhuǎn)氨酶；裂解酶等）結(jié)合上述兩個原則來命名（琥珀酸脫氫酶）有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)（Pepsin、Trypsin、鹼性磷酸脂酶和酸性磷酸脂酶）。優(yōu)點(diǎn)：簡單易記缺點(diǎn)：不能充分反映酶作用特點(diǎn)5.2.1酶的命名16(2)國際系統(tǒng)命名法

（國際酶學(xué)委員會１９６１年提出）系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶字。例如：習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)系統(tǒng)名稱:Ala：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶催化的反應(yīng):-ketoglutarate+Ala

Glu+Pryvate

GPT丙酮酸-酮戊二酸175.2.2酶的分類（一）國際系統(tǒng)分類法記住6大類的編號:氧轉(zhuǎn)水裂異合18

例如：LDH(乳酸脫氫酶)的編號是：

LDHLacticacid＋NAD+Pyruvate＋NADH219氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，LDH催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1.氧化-還原酶類Oxido-reductases20轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2.轉(zhuǎn)移(移換)酶類Transferases21水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括Amylase、Proteinase、Nuclease及Lipase等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3.水解酶類

Hydrolases22主要包括醛縮酶、水化酶（脫水酶）及脫氨酶等。裂合酶催化從底物分子中移去一個基團(tuán)或原子而形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。例如，蘋果酸裂合酶即延胡索酸水合酶(Fumarase)催化的反應(yīng)。4.裂合（裂解）酶類Lyases延胡索酸蘋果酸23異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。5.異構(gòu)酶類Isomerases6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖24合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP（或其他高能化合物）分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===A－B+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。

Pryvate+CO2oxoloacetate

草酰乙酸(OAA)6.合成酶類LigasesorSynthetases丙酮酸25結(jié)合酶(conjugatedenzyme)單純酶

(simpleenzyme)僅由氨基酸構(gòu)成的酶。酶蛋白(apoenzyme)輔助因子(cofactor)全酶(holoenzyme)決定反應(yīng)的特異性決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)（二）按酶的化學(xué)組成分類26金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。

金屬激活酶(metal-activatedenzyme)金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密。輔助因子(cofactor)金屬離子小分子有機(jī)化合物27金屬離子的作用參與催化反應(yīng)，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；穩(wěn)定酶的構(gòu)象；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。小分子有機(jī)化合物的作用參與酶的催化過程，在反應(yīng)中傳遞電子、質(zhì)子或一些基團(tuán)。28輔助因子按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度分為

輔酶(coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。

輔基(prostheticgroup):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。29單體酶(Monomericenzyme)：一般由一條肽鏈組成，如Lysozyme、Trypsin、Papain(木瓜蛋白酶)等。但有的單體酶有多條肽鏈組成，如胰凝乳蛋白酶由3條肽鏈，鏈間由二硫鍵相連構(gòu)成一個共價整體。寡聚酶(Oligomericenzyme)：由2個或2個以上亞基組成，亞基間可以相同也可不同。亞基間以次級鍵締合。如3-磷酸甘油醛脫氫酶、LDH等。多酶體系(Multienzymesystem)：由幾種酶靠非共價鍵彼此嵌合而成。主要指結(jié)構(gòu)化的多酶復(fù)合體如丙酮酸脫氫酶系、脂肪酸合成酶復(fù)合體等。多功能酶（Multifunctionalenzyme）:一些多酶體系在進(jìn)化過程中由于基因的融合，形成由多肽鏈組成并具有多種不同催化功能的酶，稱為多功能酶或串珠酶。

（三）根據(jù)酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分類30酶的聚集方式酶11.松散排列酶在細(xì)胞中各自以可溶的單體形式存在，彼此沒有結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。反應(yīng)時酶是隨機(jī)擴(kuò)散，催化效率不高。（如糖酵解歷程）酶2酶3酶4酶531酶的聚集方式2.簇式排列

幾種酶有機(jī)地聚集在一起，精巧的鑲嵌成一定的結(jié)構(gòu)，定向轉(zhuǎn)移，形成多酶復(fù)合體。催化效率高。（如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、脂肪酸合成酶復(fù)合體）酶2酶3酶1酶4酶6酶532酶的聚集方式3.與生物膜結(jié)合一種結(jié)構(gòu)更高的多酶復(fù)合體，酶整齊的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸鏈）酶1酶2酶4酶5酶333（四）、酶的活性中心必需基團(tuán)(essentialgroup)酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)中，一些與酶活性密切相關(guān)的基團(tuán)。酶的活性中心(activecenter)或稱活性部位(activesite)，指必需基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。34活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)(bindinggroup)與底物相結(jié)合催化基團(tuán)(catalyticgroup)催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。活性中心外的必需基團(tuán)構(gòu)成酶活性中心的常見基團(tuán)：

His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH。35底物活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心3663375.3

酶促反應(yīng)的動力學(xué)

1.

酶活力（enzymeactivity）：也稱酶活性，指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小可用在一定條件下，它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度（reactionrate）來表示。

2.

酶反應(yīng)速度：用單位時間內(nèi)、單位體積中S的減少量或P增加量或一定量的S轉(zhuǎn)化為P所需要的時間來表示。單位：濃度/單位時間一、酶活力與酶反應(yīng)速度SPE通常測定P的增加量來表示酶反應(yīng)速度38

引起酶反應(yīng)速度降低的原因：底物濃度的降低；酶的部分失活；產(chǎn)物對酶的抑制；產(chǎn)物增加引起的逆反應(yīng)速度的增加等。所以，研究酶反應(yīng)速度以酶促反應(yīng)的初速度（Initialspeed）為準(zhǔn)，測定酶促反應(yīng)速度必須在初速度時間內(nèi)測定。初速度概念:

指反應(yīng)剛剛開始的速度或底物消耗<5%的速度酶促反應(yīng)速度曲線393、酶的活力單位

(1).酶的活力單位（U,Activityunit）：1961年，提出用“國際單位”（IU）表示酶活力，即：1個酶活力單位，是指在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量，或轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾有關(guān)基團(tuán)的酶量。(25C,最適底物濃度和最適pH）1IU=mol/min1972年，提出新的酶活力國際單位：最適條件下，每秒鐘能催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定為1Kat=1mol/s所以：1Kat=6×107IU

(2).酶的比活力(Specificactivity,S.A)：每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)，用U/mg蛋白、IU/mg蛋白、Kat/mg蛋白表示。實(shí)質(zhì)表示單位蛋白質(zhì)的催化能力。40（1）分光光度法（Spectrophotometry）：多利用產(chǎn)物在紫外或可見光部分的光吸收性質(zhì)，選擇適當(dāng)波長，測定反應(yīng)過程的進(jìn)行情況。簡便、節(jié)約時間和樣品，可以檢測nmol/L水平的變化。蘋果酸+NAD+

草酰乙酸+NADH2(NAD+在340nm無吸收)（NADH2在340nm有吸收）

SucroseFru+Glc產(chǎn)物

4、酶活力測定方法蘋果酸脫氫酶Sucrase3,5-二硝基水楊酸Redcolor4142（2）熒光法(Fluorometry)：主要利用底物或產(chǎn)物的熒光性質(zhì)。靈敏度高，但易受到干擾。（3）同位素測定法：同位素標(biāo)記底物，反應(yīng)后經(jīng)分離，檢測產(chǎn)物的脈沖數(shù)，即可換算成酶的活力單位。靈敏度最高。（4）電化學(xué)方法：pH計、氧電極法

甘油酯FA+GlycerolLipase1.加OH＋維持pH恒定，消耗OH＋的量代表酶活性的大小2.測定pH的降低程度，表示酶活性的大小3.其他方法43二、酶促反應(yīng)的機(jī)理（一）酶-底物復(fù)合物的形成與誘導(dǎo)契合假說*誘導(dǎo)契合假說(induced-fithypothesis)酶底物復(fù)合物E+SE+PES酶與底物相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。44鎖－鑰學(xué)說45誘導(dǎo)契合假說46（二）酶促反應(yīng)的機(jī)制1.鄰近效應(yīng)與定向排列2.多元催化3.表面效應(yīng)(surfaceeffect)47

多元催化

酶活性中心催化基團(tuán)通過多種途徑催化產(chǎn)物的生成

1．質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)都包含廣義酸-堿催化反應(yīng)

2．酶可與底物形成瞬時共價鍵(共價催化)

3．酶可通過親核催化或親電子催化加速反應(yīng)

48在疏水環(huán)境中進(jìn)行酶反應(yīng)有很大的優(yōu)越性，此現(xiàn)象稱為表面效應(yīng)（surfaceeffect）。

酶的活性中心多位于其分子內(nèi)部的疏水“口袋”中，酶反應(yīng)在酶分子內(nèi)部的疏水環(huán)境中進(jìn)行。疏水環(huán)境可使底物分子脫溶劑化（desolvation）。排除水分子的干擾，防止酶和底物分子之間形成水化膜。

表面效應(yīng)49酶促反應(yīng)動力學(xué)研究酶促反應(yīng)速度及其各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。三、酶促反應(yīng)動力學(xué)50幾個概念酶促反應(yīng)速度：用單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量表示研究酶促反應(yīng)動力學(xué)要采用初速度初速度：反應(yīng)速度與時間呈正比的階段。反應(yīng)10min.或底物消耗在5%51單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)酶促反應(yīng)速度用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以內(nèi)）時的反應(yīng)速度研究前提52（一）、底物濃度對反應(yīng)速度的影響53當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。[S]VVmax54隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。[S]VVmax55當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)[S]VVmax5657※1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelisequation)。ＶVmax[S]

Km+[S]＝當(dāng)[S]＜＜Km時，v∝[S]；當(dāng)[S]＜＜Km時，v≈Vmax5820世紀(jì)初觀察到酶被底物所飽和的現(xiàn)象。當(dāng)[E]、T、pH恒定時，在[S]很低的范圍內(nèi)，反應(yīng)初速度(v)與[S]成正比：

v=k[S]當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)一定限度時，

V=Vmax米氏方程式(Michaelis-mentenequation)59三個假設(shè)底物的濃度顯著的超過酶的濃度測定的速度為初速度在測定初速度的過程中中間絡(luò)合物ES的濃度維持恒定。即達(dá)到平衡態(tài)。6061（穩(wěn)態(tài)）6263（米氏常數(shù)）64656667E=EnzymeS=SubstrateP=ProductES=Enzyme-Substratecomplexk1rateconstantfortheforwardreactionk-1=rateconstantforthebreakdownoftheEStosubstratek2=rateconstantfortheformationoftheproducts68當(dāng)[S]Km時，v=Vmax[S]/Km當(dāng)[S]Km時,v=Vmax當(dāng)[S]=Km時,v=Vmax/26970Km單位為mol/L71727.Km與Ks(特例)

Km不等于Ks(ES的解離常數(shù),底物常數(shù)）。在K2<<K-1時，Km看作Ks，也只有此時1/Km才可以近似表示酶與底物結(jié)合的難易程度。8.Km與Km

無抑制劑時，ES的分解速度與形成速度的比值符合米氏方程，為Km;而有抑制劑時發(fā)生變化，則不符合米氏方程，為Km(表觀Km)。

K-1+K2K-1Km=當(dāng)K2<<K-1時，Km=

Ks=

K1K1S+EESE+PK1K－1K273

米氏方程的應(yīng)用A、可以根據(jù)所要求的速度，求出應(yīng)加入底物的合理濃度，或根據(jù)底物濃度求反應(yīng)速度，如：例1.欲使V=99%Vmax,其底物的濃度應(yīng)為：欲使V=90%Vmax,其底物的濃度應(yīng)為：74例2.過氧化氫酶的Km為25mmol，底物的濃度為100mmol，求反應(yīng)速度v。v=Vmax80%75[S]v1000km0.999V100km0.99V10km0.91V3km0.75V1km0.50V0.33km0.25V0.10km0.091V76B、鑒定酶:通過測定Km,可鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶。C、判斷酶的最適底物：一種酶如果可以作用于幾個底物，就有幾個Km值。測定各種底物的Km值，可以找出酶的最適底物，Km值最小的是最適底物。77丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脫氫酶（1.7×10-5）丙酮酸脫氫酶（1.3×10-3）丙酮酸脫羧酶（1.0×10-3）當(dāng)丙酮酸濃度較低時，代謝走哪條途徑?jīng)Q定于km最小的酶。

km

可以推斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝途徑。78（二）、酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)[S]＞＞[E]，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。0V[E]關(guān)系式為：V=K3[E]79雙重影響（三）、溫度對反應(yīng)速度的影響最適溫度(optimumtemperature)：酶促反應(yīng)速度最快時的環(huán)境溫度。體內(nèi)大多數(shù)酶的最適溫度在35~40℃之間。最適溫度不是酶的特征性常數(shù)。低溫不使酶破壞。酶活性0.51.02.01.50102030405060溫度oC80pH影響酶與底物的親和力。最適pH(optimumpH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH

接近中性，少數(shù)例外。最適pH不是酶的特征性常數(shù)測定酶活性時，應(yīng)選用適宜的緩沖液，以保持酶的活性。（四）pH對反應(yīng)速度的影響81最適pH(optimumpH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。0酶活性pH胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶24681082

抑制作用:凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱做酶的抑制劑（inhibitor，I）。很多藥物、毒物、抗代謝物等都是酶的抑制劑。

失活作用:使酶蛋白變性失活（酶的鈍化）的因素稱變性劑。如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，它們不屬于抑制劑。去激活作用:某些酶(金屬激活酶)只有在金屬離子存在下才能很好地表現(xiàn)其活性,如果用金屬螯合劑去除金屬離子會引起這些酶活性的降低或喪失.（五）、抑制劑對反應(yīng)速度的影響8384

不可逆性抑制作用*概念抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活，不能用透析、超濾等方法予以除去。

*舉例：有機(jī)磷化合物羥基酶解毒------解磷定(PAM)重金屬離子及砷化合物巰基酶解毒------二巰基丙醇(BAL)

85

有機(jī)磷化合物對羥基酶的抑制86

膽堿酯酶乙酰膽堿膽堿+乙酸乙酰膽堿堆積引起付交感興奮癥狀：惡心，嘔吐，多汗，肌肉震顫，瞳孔縮小87路易士氣失活的酶巰基酶失活的酶酸BAL（二巰基丙醇）巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物88可逆性抑制作用*概念抑制劑以非共價鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制*類型891.競爭性抑制作用定義抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。9091+++EESIESEIEP92競爭性抑制93*特點(diǎn)抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及［S］；I與S結(jié)構(gòu)類似，競爭酶的活性中心；動力學(xué)特點(diǎn)：Vmax不變，表觀Km↑。抑制劑↑無抑制劑1/v

1/[S]94*舉例（1）.丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸95（2）.磺胺藥對細(xì)菌FH2合成酶的抑制（3）.抗代謝物的抗癌作用:5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤等96972.非競爭性抑制抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，底物與抑制劑之間無競爭關(guān)系。98非競爭性抑制99*特點(diǎn)抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合；抑制程度取決于［I］；動力學(xué)特點(diǎn)：Vmax↓，表觀Km不變。抑制劑↑1/v1/[S]無抑制劑1003.反競爭性抑制抑制劑僅與酶和底物形成的中間產(chǎn)物結(jié)合，使ES的量下降。101反競爭性抑制102*特點(diǎn)抑制劑只與ES結(jié)合；抑制程度取決與［I］及［S］；動力學(xué)特點(diǎn)：Vmax↓，表觀Km↓。抑制劑↑1/V1/[S]無抑制劑?103各種可逆性抑制作用的比較

作用特征競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制與I結(jié)合的組分EE、ESES表觀Km增大不變減小Vmax不變降低降低104各種可逆性抑制作用的比較

105（六）、激活劑對反應(yīng)速度的影響激活劑(activator)使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。

?酶的激活劑大多是無機(jī)離子?必需激活劑(essentialactivator)：對酶促反應(yīng)是不可缺少的。?非必需激活劑(non-essentialactivator)：激活劑不存在時，酶仍有一定的催化活性。106

5.4酶的調(diào)節(jié)

TheRegulationofEnzyme

107

催化單向不可逆反應(yīng)或非平衡反應(yīng)的酶，一般位于代謝途徑的起始或分支處，決定整個代謝的方向和速度；催化反應(yīng)速度最慢的酶稱為限速酶；這類酶受底物的控制，還受多種代謝物或效應(yīng)劑的調(diào)節(jié)，是可調(diào)節(jié)酶。關(guān)鍵酶（KeyEnzyme）：108酶活性的調(diào)節(jié)（快速調(diào)節(jié)）酶含量的調(diào)節(jié)（緩慢調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)對象關(guān)鍵酶109一、酶活性的調(diào)節(jié)（一）酶原與酶原的激活酶原(zymogen)有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，此前體物質(zhì)稱為酶原。酶原的激活在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過程。110賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活過程111胰蛋白酶原的激活過程112113酶原激活的機(jī)理酶原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽在特定條件下114酶原激活的生理意義避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。115（二）變構(gòu)酶（Allostericenzyme）

變構(gòu)效應(yīng)劑(allosteric

effector)變構(gòu)激活劑變構(gòu)抑制劑變構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)變構(gòu)酶(allostericenzyme)變構(gòu)部位(allostericsite)一些代謝物可與某些酶分子活性中心以外的部位可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構(gòu)調(diào)節(jié)。116

變構(gòu)酶（Allostericenzyme）變構(gòu)酶也稱別構(gòu)酶，它是代謝過程中的關(guān)鍵酶(Keyenzyme）。通過效應(yīng)物（調(diào)節(jié)物）和酶的別構(gòu)中心的結(jié)合來調(diào)節(jié)其活性，從而調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度和代謝過程。

Allostericenzyme:一種其活性受到結(jié)合在活性部位以外部位的其它分子調(diào)節(jié)的酶，[S]與v作圖為S形曲線，并非雙曲線。

117118變構(gòu)調(diào)節(jié)舉例

119變構(gòu)調(diào)節(jié)120變構(gòu)酶的特點(diǎn)①

通常具有四級結(jié)構(gòu)，存在協(xié)同效應(yīng)；②含有催化亞基和調(diào)節(jié)亞基（或催化部位和調(diào)節(jié)部位）。

酶分子中除了有結(jié)合底物并催化反應(yīng)的Activecenter外，還有可以結(jié)合調(diào)節(jié)物的Allostericcenter?；钚灾行暮蛣e構(gòu)中心可能位于不同的亞基或相同的亞基的不同部位。③[S]-v關(guān)系曲線為S形。

④變構(gòu)劑與酶非共價結(jié)合。121幾個相關(guān)概念別構(gòu)效應(yīng)（Allostericeffect）：調(diào)節(jié)物或效應(yīng)物與酶分子上的別構(gòu)中心結(jié)合后，誘導(dǎo)出或穩(wěn)定住酶分子的某種構(gòu)象，使酶活性中心對底物的結(jié)合和催化作用受到影響，從而調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度及代謝過程，此效應(yīng)即為酶的別構(gòu)效應(yīng)。

協(xié)同效應(yīng)(Cooperativeeffect):一分子L(配體)與E結(jié)合后對第二分子L結(jié)合的影響。122正協(xié)同效應(yīng)負(fù)協(xié)同效應(yīng)同種正協(xié)同效應(yīng)異種正協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)異種負(fù)協(xié)同效應(yīng)同種負(fù)協(xié)同效應(yīng)123別構(gòu)酶的動力學(xué)及別構(gòu)酶對酶反應(yīng)速度的調(diào)節(jié)1.大多數(shù)別構(gòu)酶具有正協(xié)同效應(yīng)（酶分子結(jié)合一分子底物或效應(yīng)物后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，這種新的構(gòu)象有利于后續(xù)分子與酶的結(jié)合，大大促進(jìn)后續(xù)分子與酶的親合性），其初速度與底物濃度的關(guān)系呈S形的v-[S]曲線。

當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生很小的變化時，別構(gòu)酶就極大地控制著反應(yīng)速度。在正協(xié)同效應(yīng)中使得酶反應(yīng)速度對底物濃度的變化極為敏感。1242.另一類別構(gòu)酶具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)，其動力學(xué)曲線在表現(xiàn)上與雙曲線相似，但意義不同[s]具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶在底物濃度較低的范圍內(nèi)酶活力上升快，但再繼續(xù)下去，底物濃度雖有較大的提高，但反應(yīng)速度升高卻較小。使得酶反應(yīng)速度對底物濃度的變化不敏感正負(fù)125區(qū)分酶的類型有兩種標(biāo)準(zhǔn)（P188）a.Koshland標(biāo)準(zhǔn)：CI（cooperativityindex）協(xié)同指數(shù)：酶分子中的結(jié)合位點(diǎn)被底物飽和90%與飽和10%時底物濃度的比值。亦稱飽和比值Rs(saturationratio)

位點(diǎn)被90%飽和時的底物濃度位點(diǎn)被10%飽和時的底物濃度

Rs=81米氏類型酶

Rs81具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶

Rs81具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶b.Hill系數(shù)：

Hill系數(shù)(n)=1米氏類型酶

Hill系數(shù)(n)

1具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶

Hill系數(shù)(n)

1具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶Rs=126以[S]對V作圖：正調(diào)節(jié)為典型的S形曲線，大大有利于對v的調(diào)節(jié)

M氏酶為雙曲線，[S]和效應(yīng)劑濃度變化對v不敏感，無調(diào)節(jié)作用負(fù)調(diào)節(jié)為近似雙曲線

激活劑存在時，S曲線向左移（趨于雙曲線），協(xié)同效應(yīng)減弱抑制劑存在時，S曲線向右移（S形加重），協(xié)同效應(yīng)加強(qiáng)無抑制劑和激活劑時，E對[S]變化為S曲線127變構(gòu)酶常為多個亞基構(gòu)成的寡聚體，具有協(xié)同效應(yīng)變構(gòu)激活變構(gòu)抑制變構(gòu)酶的Ｓ形曲線[S]V無變構(gòu)效應(yīng)劑128變構(gòu)調(diào)節(jié)的意義①快速調(diào)節(jié)；②總產(chǎn)物可抑制該途徑起始的酶—反饋抑制，這可保證代謝物生成不致過多，保證能量的有效利用，不致浪費(fèi)；③使不同代謝途徑互相協(xié)調(diào)。129（三）酶的共價修飾調(diào)節(jié)共價修飾(covalentmodification)在其他酶的催化下，酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾。常見類型磷酸化與脫磷酸化（最常見）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與－S－S互變130Phosphorylationanddephosphorylation磷酸化去磷酸化131

132共價修飾調(diào)節(jié)的特點(diǎn)①受共價修飾的酶存在有（高）活性和無（低）活性兩種形式；②具有瀑布效應(yīng)（級聯(lián)效應(yīng)）；③調(diào)節(jié)效率高于別構(gòu)調(diào)節(jié)；④磷酸化要消耗ATP;⑤是體內(nèi)經(jīng)濟(jì)、有效的快速調(diào)節(jié)方式。133級聯(lián)效應(yīng)A1AE×10B1BE×100C1CE×1000SP×10000134二酶含量的調(diào)節(jié)（一）酶蛋白合成的誘導(dǎo)和阻遏誘導(dǎo)作用(induction)阻遏作用(repression)（二）酶降解的調(diào)控1351.概念

同工酶是指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、組成卻有所不同的一組酶,一般為寡聚蛋白。2.同工酶舉例：1959年，Marker首先用電泳分離法發(fā)現(xiàn)動物的乳酸脫氫酶（LDH）具有多種分子形式。LDH5(M4)LDH4(M3H)LDH3(M2H2)LDH2(MH3)LDH1(H4)

三同工酶（Isoenzyme）136

Distribution：Heart－LDH1

Muscle－LDH5137

心、肝病變時引起的血清LDH同工酶的變化規(guī)律：

心臟疾病

LDH1和LDH2上升，LDH4和LDH5下降。

急性肝炎

LDH5明顯上升，隨病情好轉(zhuǎn)而恢復(fù)正常。

3.研究同工酶的意義

（1）進(jìn)行遺傳分析、雜種優(yōu)勢的篩選、抗逆指標(biāo)篩選（2）進(jìn)行疾病診斷（3）研究代謝規(guī)律138臨床意義心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345139四Ribozyme核(糖)酶Ribozyme是一種RNA生物催化劑Ribozyme的發(fā)現(xiàn)：RNA具有酶的催化功能是由CechT.R于1982年提出的。1981年，發(fā)現(xiàn)四膜蟲（tetrahymenathermophila）的26SrRNA前體在成熟過程中，其居間序列通過剪接反應(yīng)被除去。并證明四膜蟲rRNA前體的居間序列核糖核酸（L-19RNA）具有多種催化功能，將這種具有催化活性的RNA稱為Ribozyme(ribonucleicacidenzyme)。獲得1989年諾貝爾化學(xué)獎。140rRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即rRNA前體（大約6400個核苷酸殘基）很不穩(wěn)定，在鳥苷和Mg2+存在下切除自身的內(nèi)含子（Intron或Interveningsequence,IVS-居間序列或間插序列），使兩個外顯子(Exon)拼接起來，形成成熟的rRNA_——此過程沒有任何蛋白質(zhì)酶參與，稱為自我剪接（Self-splicing）,并證明RNA具有催化活性。141

四膜蟲rRNA成熟中RNA的剪接示意圖142Ribozyme在一定條件下，高度專一地催化下列反應(yīng)，具有相應(yīng)酶的活性（底物專一、符合米氏方程、對競爭性抑制劑敏感）

1.核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2.磷酸二酯酶活性CpCpCpCpC

CpCpCpC+Cp3.磷酸轉(zhuǎn)移酶活性CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4.RNA限制性內(nèi)切酶活性另外，1997年，Zhang和Cech證明了人工合成的RNA分子具有肽基轉(zhuǎn)移酶活性。143Ribozyme發(fā)現(xiàn)的重大意義：RNA具有酶的催化活性，向酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一傳統(tǒng)概念提出了挑戰(zhàn)。在理論上，對于生物起源和生命進(jìn)化的研究具有重要啟示。

生物催化分子進(jìn)化的可能性：

RNARNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-RNA蛋白質(zhì)-輔酶或輔基蛋白質(zhì)在實(shí)踐上，由于Ribozyme的內(nèi)切酶活性，可定點(diǎn)切割mRNA，破壞mRNA，抑制基因表達(dá)，為基因、病毒和腫瘤治療提供了可行途徑。144根據(jù)酶的合成與代謝的關(guān)系，人們把酶相對地分為結(jié)構(gòu)酶（structuralenzyme）和誘導(dǎo)酶(inducedenzyme)

結(jié)構(gòu)酶—是指細(xì)胞中天然存在的酶，其含量較為穩(wěn)定，受外界的影響小。誘導(dǎo)酶—指細(xì)胞中加入特定誘導(dǎo)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶，其含量在誘導(dǎo)物存在下顯著增高，這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身。如E.Coli培養(yǎng)基中含：葡糖和乳糖—但只有葡糖酵解酶類（結(jié)構(gòu)E）。只有乳糖—開始代謝下降，一段時間后代謝上升，產(chǎn)生了有關(guān)半乳糖代謝的三種酶。酶的生成受代謝物和遺傳基因的雙重控制五誘導(dǎo)酶（Inducedenzyme）145抗體酶—指具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可變區(qū)賦予了酶的屬性。是抗體的高度選擇性與酶的高效催化性相結(jié)合的產(chǎn)物?？贵w酶的應(yīng)用前景：

1.為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提供新手段

2.設(shè)計抗腫瘤等的新型生物藥物3.應(yīng)用于工業(yè)制藥（立體專一性抗體酶）六抗體酶（Abzyme）22h2005.10.12146

5.6Enzymeengineering簡介1971年第一屆國際酶工程會議上得到命名。主要研究：酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造及其在工、農(nóng)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。天然酶在開發(fā)和應(yīng)用方面受到限制：1.酶的不穩(wěn)定性2.酶的分離、純化較難，成本高，價格貴

酶工程的概念147目前在酶的應(yīng)用方面所采取的一般方法：

1.化學(xué)方法：通過對酶的化學(xué)修飾或固定化處理，改善酶的性質(zhì)以提高酶的效率和降低成本，或通過化學(xué)合成法制造人工酶。2.利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶以及對酶基因進(jìn)行修飾或設(shè)計新基因，生產(chǎn)出性能穩(wěn)定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。148

化學(xué)酶工程亦稱初級酶工程，指天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及人工模擬酶的研究和應(yīng)用。

1.天然酶：主要指工業(yè)用酶，從微生物發(fā)酵得到的酶。如：洗滌劑、皮革生產(chǎn)中用的蛋白酶；紙張制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。

2.化學(xué)修飾酶：用于醫(yī)藥及研究工作。通過（1）

化學(xué)修飾酶的功能基；（2）通過交聯(lián)反應(yīng)；（3）大分子修飾作用（用葡聚糖修飾SOD增加其半壽期，提高耐熱性、耐酸堿性等。用葡聚糖和聚乙二醇修飾尿激酶等）。

3.固定化酶(Immobilizedenzyme)：將水溶性酶用物理或化學(xué)方法，使之成為不溶于水的，但仍具有酶活性的狀態(tài)。

4.人工模擬酶—化學(xué)法合成酶（已知酶的活性中心和作用機(jī)理）。5.6.1化學(xué)酶工程1493.固定化酶

1971年在第一屆國際酶工程會議上正式采用固定化酶名稱酶的固定化方法：物理法：吸附法和包埋法化學(xué)法：共價偶聯(lián)法和交聯(lián)法目前，我國利用固定化氨基?；覆鸱諨L-AA；固定化的葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖玉米糖漿；150生物酶工程亦稱高級酶工程，是酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。生物酶工程的主要內(nèi)容：克隆酶—用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（-淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）突變酶—對酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶（改變酶的催化活性、底物專一性、最適pH、改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)能力、改變酶對輔酶的要求、提高酶的穩(wěn)定性）

制造新酶—設(shè)計新酶基因，合成自然界不曾有過的酶5.6.2生物酶工程151酶的分離提純與活力測定酶活力（酶活性，enzymeactivity）是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶量很難用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示。常用酶活力來表示酶量，即酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力。152一．酶活力及其測定在一定條件下酶催化的化學(xué)反應(yīng)速度可反映酶活力。酶促反映速度越大，酶活力越強(qiáng)。酶促反應(yīng)速度(Eactionrate)可用單位時間、單位體積中底物的減少或產(chǎn)物的增加表示。如用化學(xué)滴定、比色、比旋光度、測定紫外吸收、電化學(xué)法、氣體測定等。由于產(chǎn)物是從無到有，因此一般測定產(chǎn)物的增加。153酶活力測定方法：1、測定一定時間內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)的量在一定時間內(nèi),于最適于酶的條件下測定被酶作用的底物減少的量或產(chǎn)物生成的量,通常測定產(chǎn)物生成的量。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中底物的量一般是過量的，反應(yīng)