寡核苷酸的純化與質量鑒定

/6寡核苷酸的純化與質量鑒定寡核苷酸的純化與質量鑒定市售或者委托別人合成的寡核苷酸常常已經(jīng)純化，自行合成的須經(jīng)過純化后方可應用。一、寡核苷酸的收獲和去保護基結合在合成柱內玻璃粉上的寡核苷酸鏈經(jīng)濃氨水處理后便脫落下來，核苷酸鏈上的保護基因在濃氨水中于55℃水浴中保溫6小時以上被去除，經(jīng)柱脫鹽干燥后分裝保存。一將合成柱一頭的封蓋打開，將顆粒倒入一個帶有密封墊的螺口蓋小瓶內，加入新開封的濃氨水。密封好，置55℃水浴過夜(至少6小時)。這步操作將脫支持物與去保護基兩步合并到一起，目的是為了減少脫支持物不徹底造成的寡核苷酸的丟失。合成柱不易拆開的，可在合成柱一端接上5一次性注射器，分兩次加入以上量的濃氨水，使氨水充滿合成柱并設法使之停留在柱內，留置1分5鐘后將氨水推入小瓶內，再向柱內注入第二次氨水，作用15分鐘后推出。同法進行55℃過夜處理。用注射器注入氨水需注意盡量密封，以免氨氣揮發(fā)，可將注射器的活塞插入針管內，推入的距離不要太大，以免壓力過大使氨水從柱的另一端流出。二)從5(5℃水浴中取出小瓶后不能立即開蓋以免液體因氨氣的逸出而飛濺，需將小瓶置4℃冷卻，以降低瓶內氨氣產(chǎn)生的壓力。三準備柱。2稱取10a灑在225去離子水中，待浸透后置100℃水浴中煮沸1小時。室溫下放置3分0鐘，傾去上層不沉淀小顆粒。用一個10一次性注射器制作分離柱，柱下不接導管，裝至102刻度，在頂上放一圓形濾紙片，以防止加液時攪動柱床，用0氨水洗柱，讓液體自然流干。這樣的分離柱床外水約為。準確的體積可用藍葡聚糖溶液測定。四將過夜處理的寡核苷酸濃氨水液加到柱d,用0氨氣洗滌小瓶，待液體完全進柱后將其加入柱，然后用氨水洗脫并立即收集此流出液。若重復使用柱，起碼要用0氨水洗脫，除去柱內的鹽份。五測20取4收集液用去離子水1稀釋后于20測值。六收集液適當分裝成數(shù)份如每份，于20℃凍結，在離心真空濃縮器中干燥。七離心真空干燥，然后用去離子水04溶解干粉，再真空干燥一次，將寡核苷酸溶解適當濃度備用。根據(jù)1寡核苷酸計算產(chǎn)量。為了不浪費寡核苷酸，測所用的稀釋液可以保留，可用來溶解寡核苷酸、進行5末端標記等。注意每次測定寡核苷酸濃度時應將比色杯清洗干凈，以免被其他污染。干燥的寡核苷酸可在室溫下運輸，收藏最好于低溫。二、寡核苷酸質量鑒定寡核苷酸的質量需經(jīng)電泳鑒定，確定產(chǎn)物的純度。取大約0寡核苷酸進行末端標記，操作見寡核苷酸探針標記部分）。用20聚%丙烯酰胺變性膠電泳分離，用已知長度的標記寡核苷酸作長度對照，放射自顯影。如果寡核苷酸質量很好小片段較少，用作引物時可不必純化用作探針者，必須經(jīng)過聚丙烯酰胺序列膠分離純化。三、聚丙烯酰胺變性膠分析和純化寡核苷酸一）配（制0丙烯酰胺變性膠工作液含丙烯酰胺、，甲撐雙丙烯酰胺、、尿素二裝配聚丙烯酰胺凝膠模板，根據(jù)膠的厚度計算所用膠量，制備聚丙烯酰胺凝膠，分析膠膠厚0.4，制備膠厚。三）電泳及（檢測分析1膠.：將標記好的寡核苷酸在80℃加熱5分鐘，加1/1體0積的加樣

液（0.溴0酚5藍%、液（0.溴0酚5藍%、電泳緩沖液用,上樣前預電泳分鐘。電泳，當溴酚藍進膠時停止電泳約小時。取下一面玻板，用保鮮膜覆蓋膠面。在暗室中放一張光片在樣品部位，曝光?分鐘。用記號筆作好位置標記以便定位，沖洗光片?？捎靡阎L度的寡核苷酸作大小標志，多個樣品一起分析時可以不用標志。二甲苯藍的位置相當于2個5核苷酸。位置正確的寡核苷酸帶可挖出作探針。純化制備2膠.：膠厚度一般為，上樣量為?齒寬。將寡核苷酸溶在去離子甲酰胺中，濃度為，直接加樣，不要加染料，否則會干擾觀察條帶。可在外側兩邊的樣品孔中加染料作為電泳進程的指示。當溴酚藍進膠時停止電泳，需要~小時。由于膠比較厚，電泳中產(chǎn)熱多，電壓不能過高，一般為?/以免玻板破裂，如果有恒溫循環(huán)水裝置，電壓不受限制。將一側的玻板去掉覆蓋一層保鮮膜，翻轉玻板使膠在玻板的下方，輕輕去掉玻板，再覆上一層保鮮膜。在膠下方放一塊在紫外線激發(fā)下能發(fā)熒光薄層層析板，用短波紫外線燈照射。由于吸收紫外線，在區(qū)帶處板不發(fā)熒光而呈黑色條帶，用清潔刀片切下所要的條帶。四）從制（備膠中回收寡核苷酸將膠塊放在離心管中搗磨碎，加入、酚，37℃搖混過夜。離心分離收集上清。再用抽提膠末3小時。將兩次洗脫液合并，用正丁醇濃縮液體至體積.乙醚抽提3次除去正丁醇。過e、真空干燥。也可乙醇沉淀法。大頭醫(yī)生/免責聲明1.用戶明確同意其使用網(wǎng)絡服務所存在的風險將完全由其本人承擔；因其使用網(wǎng)絡服務而產(chǎn)生的一切后果也由其本人承擔。對用戶及任何第三方不承擔任何責任。不擔2保.或保證網(wǎng)絡服務一定能滿足用戶的要求，也不擔保網(wǎng)絡服務不會中斷，對網(wǎng)絡服務的及時性、安全性、準確性也都不作任何擔?；虮ＷC。不3.保證為向用戶提供便利而設置的外部鏈接的準確性和完整性，同時，對于該等外部鏈接指向的不由實際控制的任何網(wǎng)頁上的內容，也不承擔任何責任。對4于.因不可抗力或不能控制的原因造成的網(wǎng)絡服務中斷或其它缺陷，不承擔任何責任，但將盡力減少因此而給用戶造成的損失和影響。對5于.任何自本網(wǎng)站而獲得的他人的信息、內容或者廣告宣傳等任何資訊（以下統(tǒng)稱信息），不保證真實、準確和完整性。如果任何單位或者個人通過上述信息而進行任何行為，須自行甄別真?zhèn)魏椭斏黝A防風險。否則，無論何種原因，本網(wǎng)站不對任何非與本網(wǎng)站直接發(fā)生的交易和/或行為承擔任何直接、間接、附帶或衍生的損失和責任。用6戶.同意，對于向用戶提供的下列產(chǎn)品或者服務的質量缺陷本身及其