《動物細胞工程》知識拓展

《動物細胞工程》知識拓展1.動物細胞培養(yǎng)技術是如何發(fā)展起來的？1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動物組織體外培養(yǎng)的基礎。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴大了組織生存空間。1951年，厄爾（Earle）發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomerat）設計了灌流小室，使細胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技術進一步提高了細胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對組織培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動作用。此后單層培養(yǎng)成為組織培養(yǎng)普遍應用的技術。20世紀60年代后，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術開始起步，并逐步發(fā)展。20世紀80年代后，隨著基因工程和其他細胞工程技術的發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術已成為轉(zhuǎn)基因技術、生物制藥及其他許多技術的基礎，在現(xiàn)代生物技術中發(fā)揮著重要的作用。2.為什么動物細胞要分散成單個細胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質(zhì)？細胞原代培養(yǎng)時可以分散成單個細胞培養(yǎng)，也可以用細胞群（團）、組織塊培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，最終都為細胞培養(yǎng)。分散成單個細胞、細胞群（團）后容易培養(yǎng)，細胞所需的營養(yǎng)容易供應，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時，內(nèi)部細胞的營養(yǎng)供應和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細胞在體外長時間的生存和生長就較困難。同時，分散成單個細胞培養(yǎng)，可使得在細胞水平操作的其他技術得以實現(xiàn)。用酶消化的是細胞間基質(zhì)，細胞間基質(zhì)主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，從而使細胞相互分離。3.動物細胞培養(yǎng)液是由哪些化學成分組成的？糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。4.體細胞核移植技術為什么要選擇MII期的卵母細胞做受體細胞？細胞核移植技術中能用作受體細胞的通常有MII期卵母細胞和受精卵（合子）。早期核移植技術中常用受精卵，后來基本上用MII期卵母細胞取代了受精卵，主要因為兩者的細胞質(zhì)環(huán)境不同。有人認為重組需要的因子存在于MII期卵母細胞的胞質(zhì)中，而在原核形成時這些因子已被降解或用光，因此，原核擴張后受精卵去核可引起胞質(zhì)中重組因子缺乏。成熟促進因子（MPF）是卵母細胞細胞質(zhì)中重要的胞質(zhì)影響因子，MPF的活性在卵母細胞減數(shù)分裂的MI期和MII期達到最高，受精或激活后，MPF迅速滅活，因此，MII期卵母細胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影響供體核染色質(zhì)的狀態(tài)和復制。MII期卵母細胞細胞核、細胞質(zhì)已成熟，而MI卵母細胞細胞核、細胞質(zhì)尚未成熟，其細胞質(zhì)不能支持胚胎的全程發(fā)育，因此，盡管MI期卵母細胞MPF活性也高，但不能用作受體卵母細胞。也有人認為用去核合子做受體時，可能由于合子去核時一些早期發(fā)育必需的因子隨原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏發(fā)育能力。因此，目前廣泛采用MII期卵母細胞做受體。5.已成功的動物細胞融合實例還有哪些？生物種類細胞來源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細胞—畸胎瘤細胞1978年要知道更多的實例，需經(jīng)常查閱更多科研報道。6.為什么不用兩個而要用多個細胞進行動物細胞間的融合？就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。目前動物細胞融合技術最有價值的應用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細胞（含B淋巴細胞）和一個瘤細胞雜交，我們不能確定該脾細胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細胞和瘤細胞進行融合，就可以從融合細胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。7.如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。前沿動態(tài)1.對稱融合與非對稱融合細胞融合在植物上可以克服有性雜交的不親和性，打破物種之間的生殖隔離，是擴大遺傳重組范圍的一種有效手段，也稱之為體細胞雜交，由此再生出來的植株是體細胞雜種。進行細胞融合的方式有兩種：一是將兩個物種的細胞除去細胞壁后，將完整的原生質(zhì)體融合在一起。在融合的細胞中含有兩個細胞核和兩種細胞質(zhì)，這種融合方式叫做對稱融合（symmetricfusion）。對稱融合往往由于細胞核分裂不同步而產(chǎn)生染色體排斥丟失，同時也由于兩個物種的全套基因組合在一起，好壞基因共處于一個雜種中，往往需要多次回交才能除去雜種中的不利基因，耗時長，效率低。為了較好的解決對稱融合所帶來的問題，產(chǎn)生了另外一種融合方式──非對稱融合（asymmetricfusion）。非對稱融合是指融合雙方的親本一方為完整的原生質(zhì)體（包括細胞核和細胞質(zhì)），而另一方只有部分染色體和細胞質(zhì)，或者無染色體只有細胞質(zhì)。這種融合方式可以較好的減少不利基因的重組，所得雜種只需要數(shù)次回交就可以達到改良作物的目的，耗時短，效率較高。除去染色體的方法可以用γ射線、χ射線、紫外線等物理方法，也可以用紡錘毒素等化學方法。2.單倍體的誘導方法及應用價值單倍體（haploid）是指具有配子染色體數(shù)目的個體。單倍體可以自發(fā)產(chǎn)生，也可以誘發(fā)產(chǎn)生。動物中（除蜜蜂、白蟻等外）的單倍體，由于生理上不正常，在胚胎發(fā)育時期就會死亡。植物上自發(fā)產(chǎn)生單倍體的植物很多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麥、小麥、油菜等，共有約10個科26個屬36個種的植物可以自發(fā)產(chǎn)生單倍體。除了自發(fā)產(chǎn)生單倍體外，人工誘導產(chǎn)生單倍體的方法有：（1）種間和屬間雜交。由于遠緣雜交，雖然不能受精，但在遠緣物種的花粉誘導下，卵細胞可以在未受精情況下發(fā)育成胚，這種情況在馬鈴薯、大麥、小麥、玉米中都可以發(fā)生；（2）物理和化學誘變?；ǚ劢?jīng)射線照射或化學藥品處理失去受精能力，但仍可以刺激卵細胞發(fā)育成胚；（3）雙生苗篩選。有些植物可以產(chǎn)生多胚種子，即2～3個胚共處于一個種皮中，這樣的種子可以形成單倍體植株；（4）花藥或花粉培養(yǎng)。單倍體具有很好的應用價值：在植物育種上，單倍體經(jīng)過加倍可以使后代迅速純合，縮短育種年限；由于單倍體經(jīng)加倍后，在理論上各基因位點應處于純合狀態(tài)，對后代進行選擇時，選擇到的個體代表著真實的變異，避免了雜交育種中雜交優(yōu)勢對選擇個體的干擾，提高了選擇效率；用單倍體作為轉(zhuǎn)基因的受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后基因即可純合，避免了體細胞作為受體，會由于后代分離需要多代選擇的麻煩。目前以油菜小孢子作為轉(zhuǎn)基因受體已得到轉(zhuǎn)基因植株。3.體細胞核移植與線粒體DNA目前出生的克隆動物，沒有與核供體動物完全一樣的，如在毛色花紋上就會有微細的差異。對多利羊的研究發(fā)現(xiàn)，其核外的少量DNA，即線粒體中的DNA來自于受體卵母細胞，而不像其他DNA一樣來自于供體核。法國某研究中心最近指出，現(xiàn)有的核移植技術普遍重視細胞核中的DNA，而忽視細胞質(zhì)中線粒體DNA的作用，因此無法真正克隆出一模一樣的動物。該研究中心對實驗鼠進行了12年的研究，發(fā)現(xiàn)細胞核DNA并非包含機體全部的遺傳信息，其