細(xì)胞培養(yǎng)工程 06 細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器(II)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

生物反應(yīng)器1細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)4.分子傳遞現(xiàn)象2細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)分子傳遞的基本物理現(xiàn)象擴(kuò)散（Diffusion）由于分子碰撞而傳遞熱能所引起的分子隨機(jī)運(yùn)動(dòng)舉例：氣泡外周液體滯流層內(nèi)溶解氧分子的擴(kuò)散3細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流（Convection）由于流體主體的運(yùn)動(dòng)所引起的傳遞舉例：滯流層被從氣泡外周置換離開氣泡之后，溶解氧分子隨液體流動(dòng)而位移至反應(yīng)器的其它位置擴(kuò)散在流體（氣體或液體）內(nèi)部，分子間每秒鐘發(fā)生數(shù)以萬億次碰撞，每次碰撞都會(huì)導(dǎo)致溶質(zhì)和溶劑分子的運(yùn)動(dòng)方向改變；分子的擴(kuò)散速度取決于其大小、形狀、溫度和流體粘度（流動(dòng)阻力）；宏觀效果：分子從濃度較高區(qū)域遷移至較低區(qū)域；可類比物理現(xiàn)象熱量（溫度）流體流動(dòng)（壓力）4細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)擴(kuò)散菲克第一定律（Fick’sfirstlaw）在單位時(shí)間內(nèi)，通過垂直于擴(kuò)散方向的單位截面積的擴(kuò)散物質(zhì)流量與該截面處的濃度梯度成正比，即濃度梯度越大，擴(kuò)散通量越大擴(kuò)散物質(zhì)流量：單位時(shí)間內(nèi)，分子L

通過單位面積的凈數(shù)量5細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)分子L的有效擴(kuò)散系數(shù)分子L沿?cái)U(kuò)散方向的濃度梯度擴(kuò)散：室溫下物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)范圍物質(zhì)與擴(kuò)散媒介

擴(kuò)散系數(shù)(cm2s-1)6Gasesingases0.1to0.5Gasesinliquids1x10-7to7x10-5Smallmoleculesinliquids1x10-5Proteinsinliquids1x10-7to7x10-7Proteinsintissues1x10-10to7x10-7Lipidsinlipidmembranes1x10-9Proteinsinlipidmembranes1x10-12to7x10-10數(shù)據(jù)來源：TransportPhenomenainBiologicalSystems(2nded.,2009)細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)擴(kuò)散分子尺度與分子兩次碰撞間遷移尺度比較氣體：分子大小

遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于

兩次碰撞間遷移尺度液體：分子大小

遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于

于兩次碰撞間遷移尺度7細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)擴(kuò)散Einstein’sEquationx=(2Dt)1/2x遷移距離D有效擴(kuò)散系數(shù)t擴(kuò)散時(shí)間8細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)應(yīng)用估算細(xì)胞內(nèi)分子相結(jié)合（相遇）所需時(shí)間采用偏微分方程積分方法，計(jì)算靜態(tài)液相蛋白質(zhì)分子或病毒顆粒與固定的配基、受體或細(xì)胞相結(jié)合的累積量，以優(yōu)化檢測方法對流（流動(dòng)）由于重力、壓力或剪切力的存在，流體（氣體或液體）主體發(fā)生流動(dòng)，溶于其中的溶質(zhì)隨之移動(dòng)；溶質(zhì)的擴(kuò)散現(xiàn)象同時(shí)存在如果流體流動(dòng)相對比較慢，溶質(zhì)的擴(kuò)散現(xiàn)象對其傳遞起主導(dǎo)作用；如果流體流動(dòng)相對比較快，液體主體流動(dòng)對溶質(zhì)的傳遞起主導(dǎo)作用；粘度：流體對流動(dòng)的摩擦阻力，受溫度和壓力影響密度：顯示物質(zhì)內(nèi)部分子之間的緊密程度9細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：流體概念定義：在剪切力的作用下發(fā)生連續(xù)形變的物質(zhì)分類物理狀態(tài)氣體液體可壓縮性（密度）粘度牛頓非牛頓流體10Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：流線概念定義沿著流路，并顯示流速與相對位置關(guān)系的表示方法；線條的疏密程度表示流速的相對大小。恒定流速

低流速中有障礙物

發(fā)酵罐擋板區(qū)域?qū)恿魍牧麂鰷u（Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples）細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：雷諾準(zhǔn)數(shù)（Re）流體的流動(dòng)狀態(tài)，取決于流體的流速、粘度、密度、以及流路的幾何形狀；雷諾準(zhǔn)數(shù)是用來描述流體的流動(dòng)特點(diǎn)的參數(shù)（無物理單位）12圓形橫截面管道

攪拌式發(fā)酵罐攪拌槳

D管徑υ平均線性流速ρ

流體密度μ

流體粘度層流：小于2,100過渡：2,100-4,000湍流：4,000Ni攪拌槳轉(zhuǎn)速Di

攪拌槳管徑ρ

流體密度μ

流體粘度攪拌槳形狀對液體流動(dòng)狀態(tài)影響很大，層流狀態(tài)一般低于10細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：邊界層概念定義當(dāng)流體與靜止物體相接觸時(shí)，受到影響的流體薄層被稱作邊界層；在靜止物體表面，流速為零，稱作靜止層；由于流體粘度作用，邊界層內(nèi)部與靜止層相鄰的液層流速會(huì)降低（粘滯阻力）；離靜止層越遠(yuǎn)，粘滯阻力越弱，流速越高，逐漸接近主體流速。因此，在邊界層內(nèi)部存在一個(gè)速度梯度。13意義：邊界層的存在，不僅影響流體流動(dòng)的性質(zhì)，而且會(huì)影響各相之間傳熱和傳質(zhì)。（Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples）細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：粘度概念流體薄層內(nèi)部同心圓柱體的轉(zhuǎn)動(dòng)能否帶動(dòng)外圓筒的轉(zhuǎn)動(dòng)？液體的性質(zhì)：拉拽作用力的傳導(dǎo)介質(zhì)液體介質(zhì)的作用面積直接影響作用力大小Brookfield粘度計(jì)工作原理14細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：粘度（μ）將液體注入上下兩塊平板之間，距離D，面積為A當(dāng)下板發(fā)生移動(dòng)時(shí)，流體隨其運(yùn)動(dòng)，但上板表面液體速度為零，因此形成速度梯度剪切力

F與速度梯度成正比154.剪切應(yīng)力定義Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)粘度流體的流變學(xué)分類細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)對流：粘度的意義17Gases10－40.0010.1Water0.011.00.01Glycerol10110Blood0.031.20.025粘度（常溫）

密度

運(yùn)動(dòng)粘度粘度是影響流體行為最重要的流體性質(zhì)，相當(dāng)于流體本身對流動(dòng)所施加的摩擦阻力，損耗機(jī)械能粘度對流體的泵送、攪拌混合、傳質(zhì)、傳熱和液體通氣，都有顯著作用，因此，對于生物過程設(shè)計(jì)以及經(jīng)濟(jì)成本也有重要影響培養(yǎng)液的粘度受細(xì)胞、底物和空氣影響。細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)5.攪拌式生物反應(yīng)器

液體流動(dòng)與混合18細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)部基本結(jié)構(gòu)19攪拌槳攪拌軸罐體細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器-攪拌槳主要類型MarinePitched-bladeTurbineRushtonTurbine軸向兼徑向混合

徑向混合

ElephantEar20細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器–徑向混合流型RushtonTurbine21細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)微混合為主，兼有主體混合效果，氧傳質(zhì)效果較強(qiáng)高剪切力，適合微生物發(fā)酵高H/D反應(yīng)器可配置多個(gè)攪拌槳攪拌式生物反應(yīng)器–軸向混合流型22細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)軸向主體混合為主，攪拌溫和大槳葉設(shè)計(jì)更適合大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)攪拌式生物反應(yīng)器–攪拌混合機(jī)理交換：湍流狀態(tài)下，固態(tài)物質(zhì)間發(fā)生相對運(yùn)動(dòng)剪切力：層流狀態(tài)下，液層之間相對運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散：分子水平的交換。攪拌槳作用較大漩渦較小漩渦最小漩渦擴(kuò)散作用Kolmogorovscale（cm）培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)粘性系數(shù)(cm2/s)單位質(zhì)量流體能量耗散速率(cm2/s3)細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)cell攪拌式生物反應(yīng)器–混合效果評估方法：在固定位點(diǎn)跟蹤標(biāo)示物濃度24細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器–混合效果評估Ci： 標(biāo)示物初始濃度Cf

： 標(biāo)示物最終濃度Tc

： 循環(huán)時(shí)間Tm： 混合時(shí)間，指達(dá)到所設(shè)定均勻度所需時(shí)間，

一般定義為

0.1(Cf-Ci)混合時(shí)間越短意味著混合效果越好25細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)6.攪拌式生物反應(yīng)器

氣-液傳質(zhì)26細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)引言細(xì)胞生長需要齊備的營養(yǎng)供給，限制性底物濃度對比生長速率（μ）的影響27細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)當(dāng)其中一種底物濃度（Si）降低至制約細(xì)胞生長，成為限制性底物，Monod方程當(dāng)溶解氧作為底物氧是細(xì)胞生長和代謝所必需底物之一氧在水溶液中的溶解度極低28細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)為了滿足細(xì)胞的生理要求，反應(yīng)器操作（主要是攪拌轉(zhuǎn)速和通氣流量）必須及時(shí)向培養(yǎng)體系提供氧氣，避免耗盡氧的溶解度溫度(oC)O2(mM)02.18101.70151.54201.38251.26301.16351.09401.03電解質(zhì)（M)O2(mM)HClH2SO4NaCl0.01.261.261.260.51.211.211.071.01.161.120.892.01.121.020.71一個(gè)大氣壓下，溫度對純氧在水中溶解度的影響一個(gè)大氣壓下（25oC）,純氧在不同濃度電解質(zhì)溶液中的溶解度來源：Bailey&Ollis(1986),BiochemicalEngineeringFundamentals(2nded.),p46329細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器–通氧方式（2）頂部通氧（輔助）通氧效率較低，適合細(xì)胞濃度低的接種初期階段不產(chǎn)生氣泡（1）底部通氧（主要）通氧效率高產(chǎn)生氣泡，需要采取保護(hù)措施（2）（1）細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)WAVEBioreactor-Cellbags細(xì)胞袋預(yù)先消毒，一次性使用，不必清洗通過支架的搖擺實(shí)現(xiàn)主體混合DO/CO2/pH控制0.1-500L細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)特殊細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)-溶解氧（DO）細(xì)胞生理代謝需要量最大的必需營養(yǎng)物質(zhì)：

1C6H12O6+6O2

→6CO2+6H2O氧氣以溶解氧（DO）形式在水溶液中存在，常溫下溶解度非常低一個(gè)大氣壓空氣（其中

O2占21%）37oC培養(yǎng)基溶液（鹽類溶質(zhì)的存在降低其溶解度）飽和濃度約為

0.21mM相較于葡萄糖濃度（如25mM），溶解氧不足以滿足細(xì)胞生長需要，需要不斷提供通氧（向反應(yīng)器內(nèi)部鼓氣，或培養(yǎng)基頂部界面換氣） (25-0)x6/(0.21-0)=714.3(倍)細(xì)胞膜對氧分子具有通透性，氧分子通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部32細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)在不通氧的條件下，DO耗竭需要多久？假設(shè)條件：

活細(xì)胞密度為5x106(cells/mL)

細(xì)胞比需氧量為3.2x10-13(moles/cell/hour)

培養(yǎng)基為100%空氣飽和（一般為50%左右），純氧飽和溶解度為1.0mM。計(jì)算（以1000毫升計(jì)算）：1000毫升培養(yǎng)液中DO的總量為

(1.0mMx21%-0)=0.21(mmoles)=0.21x10-32.1000毫升培養(yǎng)液中總活細(xì)胞數(shù)量為 5x106(cells/mL)x1000(mL)=5x109(cells)3.活細(xì)胞每小時(shí)的需氧量（假設(shè)不隨DO降低而變化） 5x109(cells)x3.2x10-13(moles/cell/hour)=1.6x10-3(moles/hour)

耗盡DO所需時(shí)間為 0.21x10-3(mles)/1.6x10-3(moles/hour)=0.13(hour)33細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)反應(yīng)器通氧與攪拌Casea：通氣量過高，攪拌速率過低，氣泡圍繞攪拌軸區(qū)域上升，攪拌槳起不到打散和分散氣泡的作用（最低攪拌速率）；Casee：攪拌速率過高，上升氣泡會(huì)再次回到主體，槳葉與氣泡過多接觸減少槳葉對液體的拉拽，降低液體主體的能量輸入和混合（最高攪拌速率）。34細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器–攪拌器轉(zhuǎn)向“PumpDown”-延長氣泡停留時(shí)間×35細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)氧分子從氣泡到細(xì)胞內(nèi)傳遞步驟從氣相主體擴(kuò)散到氣-液界面遷移并穿過氣-液界面擴(kuò)散并穿過第一個(gè)滯流層（最主要傳質(zhì)阻力），進(jìn)入流體主體在主體流體中傳遞，進(jìn)入第二個(gè)滯流層擴(kuò)散并穿過第二個(gè)滯流層進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部參與生化反應(yīng)（7）滯流層氣泡細(xì)胞流體主體⑥⑤④③②①細(xì)胞膜⑦氣-液傳遞37傳遞機(jī)制：成分A從氣相進(jìn)入液相，濃度梯度從氣相到液相，由高到低氣相CAGA在氣相主體的濃度CAGiA在氣-液界面的濃度kG

A的氣相傳遞系數(shù)液相CALA在液相主體的濃度CALiA在氣-液界面的濃度kLA的液相傳遞系數(shù)氣-液傳遞38氣相CAGA的氣相主體濃度CAGiA的氣液界面濃度kGA的氣相傳遞系數(shù)液相CALA的液相主體濃度CALiA的氣液界面濃度kLA的液相傳遞系數(shù)A的氣相傳遞速率:a：氣液相間界面總面積A的液相傳遞速率:氣-液傳遞39氣相CAGA的氣相主體濃度CAGiA的氣液界面濃度kGA的氣相傳遞系數(shù)液相CALA的液相主體濃度CALiA的氣液界面濃度kLA的液相傳遞系數(shù)a：氣液相間界面總面積問題：難以準(zhǔn)確測量?。?）氣-液界面變量

CAGi/CALi/a（2）氣、液相傳遞系數(shù)kG與

kL假設(shè)：（1）CAGi與CALi

的達(dá)到平衡（2）在CAGi濃度較低的情況下，CAGi與CALi

呈線性關(guān)系，m為分配因子氣-液傳遞40細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)氣-液傳遞41細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)體積傳遞系數(shù)

KLa傳質(zhì)系數(shù)（KL）氧傳質(zhì)阻力的倒數(shù)測定難度單位液體體積氣-液界面面積（a）受通氣量和攪拌速率影響測定難度體積傳遞系數(shù)

KLa可測定度量反應(yīng)器氧傳遞能力，KLa值越高，系統(tǒng)氧傳遞能力越強(qiáng)，可支持更高細(xì)胞密度生長42細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)體積傳遞系數(shù)

KLa測定

-動(dòng)態(tài)法將上式進(jìn)行積分，得到43細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)為與氣相氧濃度對應(yīng)的液相飽和溶解氧濃度體積傳遞系數(shù)（KLa）測定-動(dòng)態(tài)法通過向培養(yǎng)基液體中鼓氮?dú)?，使DO降低至一定水平關(guān)掉氮?dú)獠㈤_始鼓空氣，實(shí)時(shí)記錄溶氧濃度44細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)體積傳遞系數(shù)（KLa）測定-動(dòng)態(tài)法3.ln(C*-CL)對時(shí)間

t

作圖，計(jì)算斜率–KLa（秒-1）45細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)7.攪拌式生物反應(yīng)器中的

細(xì)胞損傷46細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)引言攪拌式生物反應(yīng)器大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)生產(chǎn)過程的主要工具培養(yǎng)過程研究與優(yōu)化，對其它反應(yīng)器類型具有指導(dǎo)意義細(xì)胞損傷生理損傷營養(yǎng)缺乏與代謝副產(chǎn)物累積與反應(yīng)器型式關(guān)系不大，所有培養(yǎng)過程都有可能發(fā)生物理損傷動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁反應(yīng)器中強(qiáng)制混合所產(chǎn)生的水力作用反應(yīng)器通氣供氧過程中的氣泡作用47細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)主體流體中的細(xì)胞損傷主體流體的基本結(jié)構(gòu)：流體環(huán)境：湍流能量發(fā)散模式：旋渦鏈：攪拌槳運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生大旋渦槳葉寬度決定旋渦大小較大旋渦衍生較小旋渦直至形成最小旋渦能量轉(zhuǎn)化：通過粘性耗散，動(dòng)能轉(zhuǎn)化成熱。在旋渦形成鏈中，能量首先以從大旋渦到小旋渦的形式傳遞；最后在最小旋渦中，通過粘性耗散轉(zhuǎn)化成熱。48細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)主體流體中的細(xì)胞損傷Kolmogorov理論：Kolmogorov尺度(KolmogorovLengthScale,cm)培養(yǎng)基液體運(yùn)動(dòng)粘性系數(shù)(cm2/s)局部單位質(zhì)量流體的能量耗散速率(cm2/s3)49細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)主體流體中的細(xì)胞損傷Kolmogorov理論詮釋：Kolmogorov尺度對應(yīng)最小湍流漩渦大小培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)粘性系數(shù)與其呈正相關(guān)關(guān)系攪拌槳能量輸入與其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系指導(dǎo)意義：與細(xì)胞或微載體尺度相當(dāng)?shù)男郎u是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要因素之一；在實(shí)際操作中，當(dāng)最小旋渦的直徑小于微載體直徑的1/2–2/3時(shí)對細(xì)胞的破壞效果最強(qiáng)；過程放大：幾何結(jié)構(gòu)相似反應(yīng)器攪拌槳轉(zhuǎn)速預(yù)測50細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)主體流體中的細(xì)胞損傷過程放大：幾何結(jié)構(gòu)相似反應(yīng)器攪拌槳轉(zhuǎn)速預(yù)測51細(xì)胞的比死亡速率（sec-1）系數(shù)攪拌槳轉(zhuǎn)速（sec-1）微載體直徑（m）反應(yīng)器體積（m3）培養(yǎng)基液體運(yùn)動(dòng)粘性系數(shù)(cm2/s)細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)主體流體中的細(xì)胞損傷過程放大：幾何結(jié)構(gòu)相似反應(yīng)器攪拌槳轉(zhuǎn)速預(yù)測

體積增大到10倍，維持比死亡速率不變52細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)主體流體中的細(xì)胞損傷攪拌槳轉(zhuǎn)速預(yù)測的經(jīng)驗(yàn)法則：反應(yīng)器幾何結(jié)構(gòu)相似反應(yīng)器體積增大到10倍，為了維持細(xì)胞的比死亡速率不變，攪拌槳轉(zhuǎn)速需要減低到原轉(zhuǎn)速的60%左右;該法則雖然來自微載體培養(yǎng)過程，但對攪拌式細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程放大仍具有指導(dǎo)意義。

53細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)氣泡相關(guān)的細(xì)胞損傷攪拌式生物反應(yīng)器在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的使用最為普遍大多以氣體直接鼓入來滿足細(xì)胞對氧的需求；直接鼓泡供氧方式最簡單有效；但是，鼓泡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。反應(yīng)器頂部通氣雖然效率較低，但在早期培養(yǎng)階段（細(xì)胞密度較低）不失為上策；其它供氧方法在大規(guī)模培養(yǎng)中有放大技術(shù)問題，但可能會(huì)在其它特殊應(yīng)用中發(fā)揮作用。54細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)氣泡相關(guān)的細(xì)胞損傷反應(yīng)器中的氣泡行為：在鼓泡器（或分布器）上的生成和釋放在液相主體中的上升在頂部空間破裂55細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)氣泡相關(guān)的細(xì)胞損傷氣泡在鼓泡器（或分布器）上的生成和釋放觀察：在相同氣體體積流量下，改變分布器氣孔氣流速率，細(xì)胞比死亡速率沒有明顯變化；結(jié)論：氣泡生成和釋放不是細(xì)胞損傷主要原因。

氣泡在液相主體中的上升觀察：尚有