細胞與細胞工程

Cell&CellEngineeringSchoolofLifeSciences,XiamenUniversityDr.GaoliangOuyang(歐陽高亮)Dr.ShuyongLin(林舒勇)2012-2013年第2學期生命科學導論安排講座號題目任課教師第一講細胞與細胞工程歐陽高亮，林舒勇第二講基因與基因工程徐虹，顧穎第三講微生物與傳染性疾病陳毅歆，陳航姿，王彥海第四講營養(yǎng)與健康金利華，周克夫第五講人類遺傳學與優(yōu)生許曄，李光第六講生物多樣性與環(huán)境保護鄭文教，楊盛昌第七講生物技術在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域的應用吳婷，程喆第八講生物倫理與社會決策張賽群，陳長平課程召集人：羅大mluo@Fertilizedeggcanbedevelopedintoembryoandusedtoisolateembryonicstemcells生命科學研究的范疇和層次核心領域：生物學（動物學，植物學等），生物醫(yī)學科學（疾病相關研究）小分子-生物大分子-細胞器-細胞-組織-器官-生物個體-群落-生態(tài)系統(tǒng)Science,Dec.2012Science2012年度十大科學進展心肌細胞肝細胞胰腺細胞……精子卵子胚胎干細胞飲食對腸道微生物組產(chǎn)生的作用，以及它們對患病風險的影響癌癥免疫學研究黑色素瘤治療方案（dabrafenib（BRAF抑制劑）和trametinib（MEK抑制劑）組合藥物）干細胞試驗的基礎研究和臨床研究單細胞測序技術人類連接組項目(HumanConnectomeProject)計劃植物學基礎研究——調(diào)控植物生長的分子遺傳學機制Science和Nature2013年度生命科學領域熱點預測Nature雜志則指出今年干細胞試驗的基礎研究和臨床研究也許會取得新進展，其編輯認為一項利用人類胚胎干細胞（hESC）進行的早期臨床試驗應該在2013年會獲得具有里程碑意義的研究結(jié)果，這個由著名的先進細胞技術公司進行的實驗，正在將源自hESC的視網(wǎng)膜細胞注入36名患有兩種形式的無法治愈的退行性失明的患者眼中。這是目前唯一一家獲得美國食品與藥物管理局（FDA）批準開展hESC治療試驗的公司，并且先進細胞技術公司希望FDA能夠為其開綠燈，從而于今年在病人中對誘導自成熟細胞的干細胞進行測試。細胞工程細胞工程是運用細胞分子生物學理論與技術，定向改造細胞乃至生物。用這種技術可以對細胞進行操作，達到定向改造生物的目的,是人們根據(jù)科學設計改變細胞的遺傳基礎，通過無菌操作，大量培養(yǎng)所需細胞，誘導形成組織甚至發(fā)育為完整個體的技術。迄今為止，人們已經(jīng)從基因水平、細胞器水平以及細胞水平開展了多層次的大量工作，在細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞代謝物的生產(chǎn)和生物克隆等諸多領域取得一系列令人矚目的成果，其中代表細胞水平的細胞工程研究也顯示其巨大的應用前景。

第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程第一節(jié)細胞的特征細胞是生命的結(jié)構和功能的基本單位。細胞是生命活動的基本單位。單細胞生物，一個細胞就是一個個體，而多細胞生物則由許多細胞成一個個體。我們所看到的生物體都是由多細胞所組成。在多細胞生物體中，由形態(tài)結(jié)構相似的細胞再組成組織，執(zhí)行著生物體中的部分功能。第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程根據(jù)細胞的內(nèi)部結(jié)構，可將生物界的細胞分為兩大類：原核細胞（prokaryotes）和真核細胞（eukaryotes）細菌、藍藻和放線菌等由原核細胞構成的有機體稱為原核生物，幾乎所有的原核生物都由單個原核細胞構成。由真核細胞構成的有機體則稱為真核生物，真核細胞大多存在于多細胞生物中。單細胞生物與多細胞生物在適應環(huán)境等方面各有千秋.（一）細胞分類一.細胞的基礎知識（二）細胞的大小和形態(tài)支原體（mycoplasma）巨型烏賊神經(jīng)細胞（nervecell）蕨藻（caulerpa）細胞形態(tài)的多樣性硅藻草履蟲無論各種細胞的大小和形態(tài)有多大的差異，它們都由一層具有一定生物學功能的細胞膜包裹在細胞外層。由于這層細胞膜將細胞內(nèi)部和外部環(huán)境分隔開，使細胞內(nèi)部的各種生命活動發(fā)生在特定的環(huán)境中保障了單細胞個體的生命活動和多細胞個體中不同功能細胞的相對獨立性，使其成為生物體的功能單位。（三）細胞的結(jié)構結(jié)構簡單，因而相對較小沒有細胞核和大多數(shù)細胞器（恒定的內(nèi)膜系統(tǒng))細菌和古細菌兩類三個結(jié)構區(qū)域：鞭毛或纖毛，胞外被膜和細胞質(zhì)I.原核細胞Prokaryoticcells

三大結(jié)構體系：生物膜系統(tǒng)：質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)（細胞器）

遺傳信息表達系統(tǒng)：染色質(zhì)(體)、核糖體、mRNA、tRNA等

細胞骨架系統(tǒng)：胞質(zhì)骨架、核骨架II.真核細胞（eukaryoticcells）chromatid具有核膜和由膜圍成的各種細胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、葉綠體、溶酶體等。內(nèi)膜系統(tǒng)將細胞質(zhì)分隔成不同的區(qū)域，即所謂的區(qū)隔化(compartmentalization)。區(qū)隔化使細胞內(nèi)表面積增加了數(shù)十倍，代謝能力增強。第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程G0期:休眠期G1期:DNA合成前期S期:DNA合成期G2期:

DNA合成后期M期:有絲分裂期（一）細胞增殖二.細胞的功能～20h細胞分裂三種方式

(二)細胞分化多細胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功能都不同的細胞群所組成。高等動、植物由受精卵細胞開始的胚胎發(fā)生過程隨著細胞分裂次數(shù)的增加而使得早期胚胎的細胞數(shù)量也增加許多。其中有些細胞在形態(tài)、結(jié)構和功能上逐漸發(fā)生了差異，這種細胞之間差異的發(fā)生過程就是細胞分化。個體發(fā)育的過程就是細胞分化的過程，個體的各種器官和組織都是通過細胞分化形成的。

囊胚原腸胚Examplesofnamesandtypesofcelldeath.(A–I)Electronmicroscopy;(J–L)phasecontrast.(A)NormalHeLacells;(B)treatedwithstaurosporintoinduceapoptosis;or(C)treatedwiththapsigargintoinduceautophagy(Galluzzietal,2007).(D)Apoptotic,and(E)necroptoticJurkatcells(Degterevetal,2005).(F)Paraptotic293Tcells(Sperandioetal,2000;copyright(2000)NationalAcademyofSciences,USA).(G)Necroticand(H)autophagiciBMKcells(Degenhardtetal,2006;Mathewetal,2007).(I)Ras-expressingU251glioblastomacellsshowingmacropinosomes(J.H.Overmeyer,A.Kaul,E.E.Johnson&W.A.Maltese,unpublisheddata).(J)Dictyosteliumcells,vegetative,(K)undergoingvacuolarautophagiccelldeath,and(L)undergoingnecroticcelldeath(Laporteetal,2007).

凋亡自吞噬凋亡壞死自吞噬壞死凋亡（apoptosis，程序性死亡），壞死（necrosis），自吞噬（autophagy），衰老（senescence）…

(三)細胞衰老和死亡Hayflick'sLimit:humancellsderivedfromembryonictissuescanonlydivideafinitenumberoftimes(~50)incultureFibroblastDivision20times50times細胞衰老LimitlessReplicativePotential

Humansomaticcellshaveafinitereplicativepotential,oncecellsprogressedthroughacertainnumberofdoublings,cellswillstopgrowing------aprocesstermedsenescence.LossofproliferativecapacitywithageApoptosisandnormalmorphogenesis(Mousepaw)細胞死亡控制失效的后果：該死的不死：腫瘤不該死的死了：退行性疾?。ˋD，Parkinson’sDisease）TumorsasComplexTissuesThetumormicroenvironmentisregulatednotonlybycancercellsbutalsobyendothelialcells,immunecellsandstromalelements

------HanahanD,WeinbergRA.Cell,2000.

(四)腫瘤CellcyclecheckpointTumorinvasion-metastasiscascade（腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移）CancersResultFromgeneticMutation

Alterationinthecell'sDNAsequence

Epigeneticchange:achangeinthepatternofgeneexpressionwithoutachangeintheDNAsequence

ChemicalcarcinogensIonizingradiationsViruses

Agentsthatgiverisetocancer

Many,butnotall,cancer-causingagentsdamageDNA

FungaltoxinaflatoxinB1ThemorepotentonesarerelativelyinertchemicallyandbecomedamagingonlyaftertheyhavebeenchangedtoamorereactiveformbymetabolicprocessesMetabolicactivationofacarcinogenZhouBB,etal.NatRevDrugDiscov.2009.Cancerstemcells(CSCs),alsoknownastumorinitiatingcellsortumorigeniccells,refertoasmallsubsetoftumorcellsthathavestem-likecellproperties,theabilitytoself-renew,differentiateintoheterogeneouspopulationsofcancercells,andseednewtumorsinaxenotransplantsystem.Cancerstemcell(腫瘤干細胞）第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程

體外培養(yǎng)細胞的基本類型形態(tài)：成纖維樣細胞和上皮樣細胞根據(jù)細胞能否在支持物上生長，分為貼附型和懸浮型。成纖維樣細胞上皮樣細胞懸浮型細胞第二節(jié)動物細胞工程一、動物細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)的基本設備無菌室無菌操作臺二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡細胞計數(shù)儀透射電子顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿培養(yǎng)板培養(yǎng)液第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程二.單克隆抗體

1975年英國科學家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細胞同腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗體技術，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。每個B淋巴細胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細胞可以無限增殖，因此雜交瘤細胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。單克隆抗體技術的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。單克隆抗體的應用分子細胞生物學基礎研究疾病的定向治療（腫瘤免疫療法，風濕性關節(jié)炎等）疾病的早期診斷超過150億美元的市場第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程三.動物克隆生物學上，克隆指的是低等生物無性繁殖產(chǎn)生遺傳信息完全一致的群體的自然存在的過程。生物技術領域，克隆指的是復制（拷貝）DNA片段（分子克?。?，細胞（細胞克隆，應用于干細胞）乃至生物體（生殖克?。┑氖侄巍Ｉ晨寺∫话阒竸?chuàng)造遺傳特性上完全一致的多細胞個體的過程，是一種無性繁殖。人為創(chuàng)造：體細胞核移植，利用顯微外科技術，將一個體細胞核移植到一個去核的卵細胞中，再植入母體子宮，便可不經(jīng)授精而發(fā)育。胚胎分裂（胚胎孿生）自然存在：個別雌性昆蟲，甲殼類和蜥蜴成熟個體的復制克隆研究的歷史及現(xiàn)狀Hansspemann,1869-19411928年進行了首次核移植實驗1935年獲諾貝爾生理醫(yī)學獎1938年預言了克隆高級生物的可能性德國胚胎生物學家（thefatherofcloning）

HansSpemann的蠑螈核移植實驗

1938年Spemann和他的學生發(fā)現(xiàn)，把發(fā)育早期的蠑螈細胞核移植到去除了細胞核的發(fā)育晚期蠑螈胚胎中，胚胎細胞可以繼續(xù)發(fā)育成為一個完整的蠑螈。1952年Briggs和King用囊胚細胞核克隆了蝌蚪RobertBriggs(1911-1983)ThomasKing

(1921-2000).紫外線照射未受精卵移核卵蝌蚪197移核卵，104個分裂發(fā)育，35各發(fā)育為胚胎，27個成為蝌蚪Thefirstclonedvertebrate囊胚細胞——分化早期的胚胎細胞1962年JohnGurdon用腸細胞（分化終末細胞）核克隆青蛙JohnGurdon(1933-)紫外線照射未受精卵移核卵蝌蚪提取腸上皮細胞核注入細胞核蝌蚪囊胚囊胚不分裂畸形胚成蛙細胞可以“重編程”克隆技術的基礎1979年KarlIllmensee宣布運用核移植法成功克隆了3只小鼠，但該結(jié)果沒有得到科學界公認1986年丹麥科學家SteenWilladsen

成功利用胚胎細胞克隆出一頭綿羊，這是首次證實的通過核移植技術克隆哺乳動物哺乳動物的克隆1995年7月

蘇格蘭Roslin研究所的IanWilmut和KeithCampbell運用早期分化的胚胎細胞克隆出了兩頭綿羊，命名為Megan和Morag,這被看作是多莉誕生的前奏1996年7月5日第一個用成年體乳腺細胞克隆產(chǎn)生的哺乳動物——綿羊多莉（Dolly）誕生July5,1996~February14,2003多莉（Dolly）RoyalMuseuminEdinburghWilmut,A.E.Schnieke,J.McWhir,A.J.KindandK.H.Campbell.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells.Nature,1997,385:810–813.克隆羊多莉引發(fā)的動物克隆熱牛，05/07/1998,日本猴，14/01/2001,美國貓，14/02/2002,美國騾，29/05/2003,美國小鼠，05/12/1999,美國駱駝，8/04/2009,阿聯(lián)酋(1)遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動物將更有利于開展對動物(人)生長、發(fā)育、衰老和健康等機理的研究；(2)有利于大量培養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的家畜;(3)經(jīng)轉(zhuǎn)基因的克隆哺乳動物，將能為人類提供源源不斷的廉價的藥品、保健品以及較易被人體接受的移植器官；(4)科學家將很快地從目前的同種克隆技術推進到異種克隆,即借腹懷胎的新領域,這無疑將大大促進對瀕臨滅種的哺乳動物的保護工作?？寺〖夹g將對21世紀產(chǎn)生的重大影響（？？？）第一節(jié)細胞的特征細胞的基礎知識細胞的生長、分化與死亡第二節(jié)動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體動物克隆干細胞工程Stemcellsarepowerfultoolsinbiologyandmedicine.Whatcanscientistsdowiththesecellstoexploittheirincrediblepotential?Adaptedfrom

PrinciplesofBiology

publishedby

NatureEducation.

JAMESKING-HOLMES/SCIENCEPHOTOLIBRARYAmouseembryoisheldinplaceduringnucleartransfer.Theegg'sgeneticmaterialhasbeenremovedandanadultcellnucleusisinjectedinitsplace.四.干細胞工程Pluripotent:cantransformintoanyoneofthe220celltypesinthehumanbody.

Self-renewal:onestemcellcanalsodividetoproducemillionsmorestemcells.1.WhatareStemCells?innearlyallanimals,fromtinywormstomiceandhumans.embryonicstemcellsadultstemcellsinducedpluripotentstem(iPS)cells2.TypesofStemCellsEmbyonicStemCellsVS.AdultStemCellsStemCells:FlexiblefriendsNature

483,

S22–S26Inthepastdecade,scientistshavealsolearnedtomakestemcellsfromregularmature,differentiatedcells.Thesecellsarecalledinducedpluripotentstemcellsbecausescientistsforcethemtobecomepluripotentevenaftertheyhavereachedadifferentiatedstate.

Byturninguptheexpressionofjustafewgenes,scientistscanforceaskincell,forexample,toretraceitsdevelopmentalpathwaybackwardsallthewaytoaflexiblepluripotentstate.

InducedPluripotentStemCells3.MedicalApplicationsStemcellscanteachusaboutthebiologyofpluripotentcells,howthehumanbodydevelops,andwhathappensduringdisease.Theyarealsoatoolfordevelopingsaferwaystodesignandtestnewmedications.theyarethebasisforregenerativemedicine,usingstemcellstorepairdamagedtissue.

……ThediscoveriesofGurdonandYamanakahaveshownthatspecialisedcellscanturnbackthedevelopmentalclockundercertaincircumstances.Althoughtheirgenomeundergoesmodificationsduringdevelopment,thesemodificationsarenotirreversible.Wehaveobtainedanewviewofthedevelopmentofcellsandorganisms.ResearchduringrecentyearshasshownthatiPScellscangiverisetoallthedifferentcelltypesofthebody.Thesediscoverieshavealsoprovidednewtoolsforscientistsaroundtheworldandledtoremarkableprogressinmanyareasofmedicine.iPScellscanalsobepreparedfromhumancells.Forinstance,skincellscanbeobtainedfrompatientswithvariousdiseases,reprogrammed,andexaminedinthelaboratorytodeterminehowtheydifferfromcellsofhealthyindividuals.Suchcellsconstituteinvaluabletoolsforunderstandingdiseasemechanismsandsoprovidenewopportunitiestodevelopmedicaltherapies.Fromsurprisingdiscoverytomedicaluse皮膚細胞iPS神經(jīng)細胞心肌細胞肝細胞精子、卵子Whyisatherapeuticcloningapproachimportant?Bygrowingnewbodypartsfromexistingonesfromthesamepersonwecanavoidtransplantrejectionproblems.Byusingcellsre-engineeredor“cloned”fromourselveswecanbecomeourowntransplantsource-similartobankingbloodforourselvesbeforeasurgicaloperation.PeopleintheUSaffectedbydiseasesthatmaybehelpedbystemcellresearchCondition NumberofPersonsAffectedCardiovasculardiseases 58MillionAutoimmunediseases 30MillionDiabetes 16MillionOsteoporosis 10MillionCancer 8.2MillionAlzheimer'sdisease 4MillionParkinson'sdisease 1.5MillionBurns(severe) 0.3MillionSpinalcordinjuries 0.25MillionBirthdefects 150,000(peryear)Total 128.4Million--------------------------------------------------------------------------------------DatafromthePatients'CoalitionforUrgentResearch,Washington,DC(accordingtoPerry,Ref.267).NATURE

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NEWSChina’sstem-cellrulesgounheededHealthministry’sattemptatregulationhashadlittleeffect.Nature

484,

149–150

(12April2012)It’sboomtimeforfirmssellingstem-celltreatments,suchasthosederivedfromumbilicalblood.LIUHAIFENG/XINHUAPRESS/CORBISNATURE

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NEWSStem-celltherapytakesoffinTexasAboominunprovenproceduresisworryingscientists.Nature

483,

13–14

(01March2012)

Celltexhoststhelargeststem-cellbankintheUnitedStates.TYLERRUDICK4.DevelopmentoftheStemCelltechniqueSource:/time/2001/stemcells/popup.htmlWherearetheStemCells?自然胚胎克隆人胚胎-核移植/混種胚胎-核移植體細胞誘導多能干細胞(體細胞轉(zhuǎn)分化)In1868,GermanbiologistErnstHaeckelfirstusedtheterm'stemcell'todescribeazygote.Researchershavebeenworkingwithmouseembryonicstemcellssince1981.

thefieldtookoffin1998,whenresearchersisolatedhumanembryonicstemcellsforthefirsttime.（最早的人類多能干細胞是從體外受精的臨床病例中得來的多余胚泡。這個里程碑式的事件是JamesThomson領導的UniversityofWisconsin,Madison的實驗室在1998年的成果。）3.1IsolationandcultureofStemCells3.2ObjectionstoStemCellReasearch2008紐卡斯爾大學將從人類皮膚細胞中提取的DNA注入來自母牛卵巢的卵子，卵子的所有遺傳物質(zhì)基本上都被去除。3.3InterspeciesEmbryos2003上海第二醫(yī)科大學盛慧珍教授研究組將人的體細胞核植入去核的兔卵細胞中。3.4AdultStemCellsdonotraisetheethicalquestionsthatembryonicstemcellsdobecausenoembryosareneeded

existinvery

smallnumbers

oftenburieddeepinthetissue

mainlyusedfortwotreatments:bone-marrowtransplantstorebuildapatient'simmunesystem,andskingraftstoreplaceskinoveraburnorotherinjuryotherapplicationsforadultstemcells？usedrugstoactivateapatient‘sownadultstemcellstoperformthenecessaryrepairs？

Foralongtime,scientiststhoughtthatonceacelldifferentiated,itcouldneverregainitspluripotency.Theyassumedthatitmustbesetinitsidentitybecauseithadsomanygenesturnedonandoffinwaysparticulartothatcelltype.In2006,however,KazutoshiTakahashiandShinyaYamanakaofKyotoUniversityinJapanprovedotherwise.Theyturnedmouseskincells—specifically,fibroblasts—intostemcells.Thesewerethefirstinducedpluripotentstem(iPS)cells.

3.5InducedPluripotentStemCells

Thefirstdirectreprogrammingofadulthumanfibroblasts.IanWilmutScottishCentreforRegenerativeMedicine,UniversityofEdinburghIn2007issuesofCellandScience,Yamanakaandcolleagues(Takahashietal.,2007)andYuandcolleagues(Yuetal.,2007)demonstratethatexpressionoffourspecifictranscriptionfactorsgivesadulthumanfibroblastsmanyofthecharacteristicsofhumanembryonicstemcells.Refinementsofthisprocedurewillmakeitpossibletoproducepluripotenthumancell