維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力

維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相互作用力

一、共價(jià)相互作用：（二硫鍵）

二硫鍵在胞外蛋白和胞內(nèi)蛋白中的功能 二硫橋作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)花樣的組成部分

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中原子間的相互作用可分為兩類：共價(jià)相互作用和非共價(jià)相互作用。二硫鍵(-S-S-)又稱作二硫橋或硫硫鍵：是指兩個(gè)硫原子之間形成的化學(xué)鍵其鍵能很大，大約為30~100Kcal/mol

，因此是一種很強(qiáng)的化學(xué)鍵。它可以把不同的肽鏈或同一肽鏈的不同部分連接起來對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象起著重要的作用。二硫鍵的形成：在細(xì)胞外大多數(shù)二硫鍵的形成是自發(fā)地，而在細(xì)胞內(nèi)它需要細(xì)胞膜上的酶系統(tǒng)來將二硫鍵引入蛋白質(zhì)。因?yàn)榧?xì)胞是依靠很強(qiáng)的還原環(huán)境所維持的，例如5mM的還原谷胱甘肽和0.01mM的氧化谷胱甘肽，在這樣的條件下蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成就不是自發(fā)的了二硫鍵在胞外蛋白中的功能：在胞外蛋白中二硫鍵決定了胞外蛋白的機(jī)械性質(zhì)例如：角蛋白蛇毒毒素蛋白和其它的毒素蛋白、多肽激素消化酶、免疫球蛋白、溶菌酶以及牛奶蛋白等，在這些蛋白質(zhì)中二硫鍵的作用對于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定SchematicmodelsofanantibodymoleculeandaFabfragment二硫鍵在胞內(nèi)蛋白中的功能：二硫鍵決定了胞內(nèi)蛋白的化學(xué)性質(zhì)，新合成的蛋白很少具有二硫鍵，通常胞內(nèi)蛋白中的二硫鍵只與功能相關(guān)而與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定無關(guān)。Thirodoxin（硫氧還蛋白）

systemSchemeofelectronflowinthethioredoxinsystem.ElectronsfromNADPHareusedtoreducethioredoxinreductase(TrxR)(aNADPH-dependentflavoprotein),whichinturnreducesthioredoxin(Trx).Reducedthioredoxinisabletoreducedisulfidebondsinawidearrayofproteinsubstrates.還原狀態(tài)氧化狀態(tài)Thioredoxin

in

yeastBaoetal.2007ThioredoxinreductaseinyeastZhangetal.2008ComplexofTrxandTrxrinE.coliLennonetal.,Science2000二、非共價(jià)相互作用

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)主要是由非共價(jià)相互作用所維系的。弱的相互作用力使得非共價(jià)鍵易于斷裂，使蛋白質(zhì)分子具有柔性。主要非共價(jià)相互作用力:范得華相互作用,靜電相互作用,疏水相互作用,氫鍵和鹽鍵等類型鍵能(Kcal/mol)

色散力－C－H……H―C―

0.03靜電相互作用－COO……H3N－

5C=O……O=C0.3氫鍵C－H……O4N－H……O=

3疏水相互作用+

+

－

－

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的非共價(jià)相互作用

1、范得華相互作用:原子間以及被化學(xué)鍵所飽和的分子間存在著弱的相互吸引力①靜電力（葛生力Keeson）；②誘導(dǎo)力(Debye力)；③色散力（London力）。

三種范得華相互作用中，色散力是占主要地位的相互作用力。

極性基團(tuán)偶極矩之間的靜電力（葛生力Keeson）：極性分子的永久偶極之間存在靜電相互作用，作用力的大小和它們的相對取向及距離相關(guān)。誘導(dǎo)力(Debye力)：得拜提出除極性分子間有靜電相互作用外，非極性的對稱分子與具有永久偶極的極性分子相互作用，可使非極性分子中的電荷密度發(fā)生形變，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩。這種極性分子的永久偶極矩與非極性對稱分子誘導(dǎo)偶極矩之間的相互作用稱為誘導(dǎo)力。色散力London力:非極性分子中的原子和分子的原點(diǎn)振動(dòng)引起的,動(dòng)態(tài)極化可使在某一瞬間電子云的重心偏離核正電荷的中心使得非極性分子產(chǎn)生瞬間偶極矩,此瞬間偶極矩將在鄰近分子中誘導(dǎo)出偶極矩，這種瞬間偶極矩與誘導(dǎo)偶極矩的相互作用力稱作色散力范得華相互作用可用Lennard-Jones勢函數(shù)表達(dá):當(dāng)兩個(gè)原子或分子相距較遠(yuǎn)時(shí)范得華引力較明顯，而當(dāng)它們彼此接近達(dá)到一定距離時(shí)開始出現(xiàn)排斥若進(jìn)一步接近則表現(xiàn)出很強(qiáng)的排斥力。色散力是占主要地位的相互作用力。原子共價(jià)鍵類型范得華半徑(?)氫1.00

雙鍵1.60碳芳香環(huán)1.70酰胺1.50氧1.35氮芳香環(huán)1.70硫酰胺1.45蛋白質(zhì)分子中的原子范得華半徑

范得華力的距離常用范得華半徑來表示兩個(gè)原子間的范得華距離，近似地為兩原子間的接觸距離。2、靜電相互作用:因?yàn)榉肿又胁煌愋偷脑有纬晒矁r(jià)鍵時(shí)成鍵電子的分布是不對稱的，因此分子中大多數(shù)的原子都帶有部分電荷，另外蛋白質(zhì)分子中極性氨基酸的側(cè)鏈也帶有部分電荷。

蛋白質(zhì)的靜電相互作用可分為蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的靜電相互作用和蛋白質(zhì)分子外部與周圍環(huán)境即溶劑的靜電相互作用。

計(jì)算靜電相互作用基本方程為Poisson方程：V2(r)=-4

(r),(r)：位置函數(shù)；(r)：電荷密度。

3、氫鍵:氫鍵是通過氫原子參與成鍵的特殊形式的化學(xué)鍵當(dāng)一個(gè)電負(fù)性較強(qiáng)的原子與氫鍵合后，繼續(xù)與另一個(gè)電負(fù)性較強(qiáng)的原子鍵合：

X－－H＋......Y－氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要因素。氫鍵的本質(zhì)是X—H之間為極性的共價(jià)結(jié)合。電負(fù)性較強(qiáng)的X原子將氫原子的電子云拉向自己一方，使X—H變?yōu)榕紭O元，從而使X原子帶有部分負(fù)電荷，而氫原子則帶有部分正電荷。當(dāng)帶有部分正電荷的H和具有孤電子對電負(fù)性較強(qiáng)的Y原子接近時(shí)它們之間存在著靜電引力，于是便形成了帶部分共價(jià)鍵性質(zhì)的氫鍵。氫鍵的鍵能一般為-3~-6Kcal/mol，介于范得華力和共價(jià)鍵之間，這樣的能量表明氫鍵既有足夠的穩(wěn)定性，提供顯著的結(jié)合能，又可以迅速解離。氫鍵類型供體－受體的距離―O―HO2.8±0.1―O―HO＝C2.8±0.1N－HO＝C2.9±0.1N－HO－2.9±0.1N－HN3.1±0.2N－HS3.7蛋白質(zhì)分子中的氫鍵

對氫鍵形成特別重要的氨基酸

酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的側(cè)鏈還有羥基；谷氨酰胺和天冬酰胺的側(cè)鏈酰胺基團(tuán)；有時(shí)，側(cè)鏈原子常常與被捕獲到的蛋白質(zhì)內(nèi)部的水分子形成氫鍵，而有時(shí)兩個(gè)供體或受體基團(tuán)之間共享一個(gè)氫鍵（分叉氫鍵）。4、疏水相互作用：疏水相互作用是由于非極性基團(tuán)的存在，引起了水分子的結(jié)構(gòu)重排，形成了水和水之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使水的有序度增加而使熵降低。

維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)最主要的因素是疏水相互作用。非極性分子在水中傾向于聚集在一起以減少表面積，這也就是蛋白質(zhì)分子中疏水內(nèi)核形成的原因。疏水性的一個(gè)重要特點(diǎn)是它的可加和性，即一個(gè)大分子的疏水性可由組成它的基團(tuán)的相對疏水性的加和得到。蛋白質(zhì)分子疏水作用大小的衡量是將一個(gè)去折疊的蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈從水中取出，然后放到一個(gè)折疊了的蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，測量得到的自由能的變化，則表示疏水相互作用的大小。實(shí)驗(yàn)上是測量一個(gè)自由氨基酸在水中和非極性溶劑中（常用乙醇和二亞烷）的相對溶解度。ΔG轉(zhuǎn)移

=

RTln[Snp/SH2O]ΔG轉(zhuǎn)移為自由氨基酸由水中轉(zhuǎn)移到非極性溶劑中的轉(zhuǎn)移自由能，Snp和SH2O

為在非極性溶劑和水中的溶解度。假定甘氨酸的ΔG轉(zhuǎn)移

=0，

將其它自由氨基酸的測量值相對甘氨酸進(jìn)行標(biāo)度，由此人們計(jì)算出了各種氨基酸的相對親水性和相對疏水性。氨基酸相對親水性(Kcal/mol)相對疏水性(Kcal/mol)氨基酸相對親水性(Kcal/mol)相對疏水性(Kcal/mol)甘氨酸(Gly)00色氨酸(Trp)8.283.4亮氨酸(Leu)0.111.8酪氨酸(Tyr)8.52.3異亮氨酸(Ile)0.24(2.5)谷胺酰胺(Gln)11.77-0.3頡氨酸(Val)0.401.5賴氨酸(Lys)11.91(-4.2)丙氨酸(Ala)0.450.5天冬酰胺(Asn)12.09-0.2苯丙氨酸(Phe)3.152.5谷氨酸(Glu)12.58-9.9半胱氨酸(Cys)3.63(-2.8)組氨酸(His)12.620.5甲硫氨酸(Met)3.871.3天冬氨酸(Asp)13.31(-7.4)蘇氨酸(Thr)7.270.4精氨酸(Arg)22.31(-11.2)絲氨酸(Ser)7.45-0.3脯氨酸(Pro)

(-3.3)氨基酸側(cè)鏈的相對疏水性和親水性

5、鹽鍵

當(dāng)一個(gè)氨基酸的氨基和與它空間相鄰的另一個(gè)氨基酸的羧基互相靠近時(shí)，形成鹽鍵。-COO......H3N-?相鄰的氨基和羧基的結(jié)合能大約為5.0Kcal/mol左右三、蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程的目的之一是提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的去折疊和折疊態(tài)之間的自由能變化之差來衡量：

ΔG＝GD－GN

蛋白質(zhì)分子的天然構(gòu)象不一定是自由能最低，最穩(wěn)定的構(gòu)象。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的天然蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都介于ΔG5-15Kcal/mol之間，這一性質(zhì)可能和其生物學(xué)功能相關(guān)。同時(shí)這一性質(zhì)也使人們有可能通過蛋白質(zhì)工程的方法來提高蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性。

在蛋白質(zhì)工程研究中，人們擬從下面幾個(gè)方面對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，以圖提高蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性：

1、疏水相互作用

2、靜電相互作用

3、氫鍵

4、二硫鍵

疏水相互作用被認(rèn)為是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，蛋白質(zhì)分子中的疏水基團(tuán)暴露于溶劑中往往會(huì)引起不利于蛋白質(zhì)折疊的自由能變化，將氨基酸從水中轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中的轉(zhuǎn)移自由能的大小可用來衡量疏水相互作用的大小。Methews等人對T4溶菌酶中的Ile做了11種的不同氨基酸殘基的替換，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)移自由能之間存在著直接的比例關(guān)系，通過計(jì)算蛋白質(zhì)折疊過程中溶劑可接觸表面積的變化來評估疏水相互作用對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。1疏水相互作用2靜電相互作用蛋白質(zhì)分子的靜電相互作用包括帶電基團(tuán)以及原子上的部分電荷之間的相互作用。定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靜電相互作用對穩(wěn)定性的影響依賴于帶電基團(tuán)的位置，例如在a螺旋的N端附近引入酸性氨基酸或在C端附近引入堿性氨基酸均可以提高蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性。靜電相互作用與溶液的pH值相關(guān)并受溶液中其它的離子的影響。3氫鍵氫鍵對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性極為重要，特別是對二級結(jié)構(gòu)的形成起著關(guān)鍵的作用。Bryan等人用隨機(jī)突變的方法誘變枯草桿菌蛋白酶BPN的基因篩選到的一個(gè)耐熱突變型蛋白酶序列,測定表明是其218位的一個(gè)Asn變成了Ser。該突變酶的1.8A分辨率的空間結(jié)構(gòu)測定表明Asn218變?yōu)镾er218后使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一條β鏈中的另外兩對氫鍵的幾何構(gòu)型得到改善，因此分子內(nèi)的氫鍵的增加使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而提高了枯草桿菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性。4二硫鍵引入二硫鍵可以減少蛋白質(zhì)去折疊的構(gòu)型熵，因此可以提高蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性。但是引入二硫鍵的前提是二硫鍵的引入不能同時(shí)增加結(jié)構(gòu)張力。在蛋白質(zhì)分子中引入二硫鍵來提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的成功實(shí)驗(yàn)首先來自于對T4溶菌酶和l阻遏蛋白的蛋白質(zhì)工程研究人們將T4溶菌酶的Ile3換成Cys3使之能與第97位的Cys形成二硫鍵NAD：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸Astereoviewshowingtheextensivehydrogenbonds(dashedlines)madebyNAD+withLeu179,Ser198,Glu199,Arg204,Leu266,Leu268andIle291(residuesshowninpink).ManyvanderWaalcontactsaremadewithothersurroundingresidues.Thewatermoleculethatisconservedindi-nucleotidebindingproteinscontainingtheRossmannfoldisalsoshown.InTkTDH,thiswaterformsfourhydrogen