現(xiàn)代分子生物學(xué)第5章

第五章分子生物學(xué)研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個(gè)世紀(jì)中葉以來(lái)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。P166基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過(guò)它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來(lái)自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。P166P166(一)工具酶1.限制性內(nèi)切核酸酶P157/166能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切末端。P157/168EcoRV2.T4DNA連接酶

從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)和分離，它是T4噬菌體基因的產(chǎn)物，由一條多肽組成，分子量為68KD。催化兩條DNA鏈的3’-OH和5’-P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個(gè)DNA分子連接在一起。圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體T4DNA連接酶催化反應(yīng)條件

必須存在Mg2+和ATP。最佳pH為7.5—7.6；溫度在37℃時(shí)酶活力最高，5℃以下活力顯著降低。由于同時(shí)必須考慮DNA的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，在進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)的溫度，對(duì)平齊末端連接—般采用20一25℃，對(duì)粘性末端連接則采用12℃左右。僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。（二）基因克隆的載體P158/167具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。（二）基因克隆的載體大腸桿菌質(zhì)粒載體:1、pSC101質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷貝。長(zhǎng)9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和SalI等3個(gè)位點(diǎn)插入外源基因，會(huì)導(dǎo)致tetr失活。

大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體示意圖。是第一個(gè)真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA，產(chǎn)量很低。2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。而松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時(shí)，使每個(gè)寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到1000~3000個(gè)，占細(xì)胞總DNA的50%左右。3、pBR322質(zhì)粒載體由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。AmpR優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量，其長(zhǎng)度為4363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來(lái)仍較為便利。具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000~3000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。4、pUC質(zhì)粒載體（包括四個(gè)部分）：(1)來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；(2)氨芐青霉素抗性基因（ampr）；(3)大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ’基因；(4)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ’基因的功能。優(yōu)點(diǎn)：更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時(shí)，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)增時(shí)，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500~700個(gè)拷貝?？捎媒M織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ‘基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用。因此，可用X-gal顯色法實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。5、pGEM-3Z質(zhì)粒長(zhǎng)度為2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ'基因。含有兩個(gè)噬菌體啟動(dòng)子（T7和SP6），為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識(shí)別位點(diǎn)。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會(huì)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。6、穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以保證外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增，能在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭，具有廣泛的用途。7、pBluescript噬菌粒載體pBluescript是指由Stratagene公司發(fā)展的一類從pUC載體派生而來(lái)的噬菌粒載體，簡(jiǎn)稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反的取向。f1（+）起點(diǎn)表示當(dāng)pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時(shí)，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點(diǎn)則表示當(dāng)pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時(shí)，可回收到lacZ基因的無(wú)意義鏈DNA。(i)在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；(ii)具有單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無(wú)輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii）編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記；(iv)含有一個(gè)lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。P160/172圖5-5重組DNA操作過(guò)程示意圖獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過(guò)一個(gè)被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA分子的增殖（圖5-5）。P171

重組DNA（基因工程/分子克隆）的主要步驟包括以下四個(gè)基本步驟(1)目的基因的獲得；(2)目的基因與載體分子在體外進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組體；(3)將人工重組的DNA分子導(dǎo)入能進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞，從而得到復(fù)制；(4)重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇和篩選圖5-5重組DNA操作過(guò)程示意圖

(a)5.2DNA操作技術(shù)5.2.1核酸凝膠電泳P173自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。P173生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場(chǎng)中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對(duì)之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。表5-2瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力P174凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1圖5-4溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。圖5-6DNA脈沖電場(chǎng)凝膠電泳示意圖P1745.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖P175細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。

在基因克隆中，通常要通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法將體外構(gòu)建好的雜種DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。外源DNA通過(guò)自身載體上的復(fù)制起始點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制增殖，能在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期保存下來(lái)，并能以完整的形式從細(xì)胞中被分離純化出來(lái)。P175為提高效率，可對(duì)受體菌進(jìn)行物理或化學(xué)處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過(guò)這種處理的細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。常用的方法：P175–CaCl2法–電擊法基因工程中常用α-互補(bǔ)來(lái)篩選重組質(zhì)粒(藍(lán)白斑篩選重組子的分子機(jī)制)，請(qǐng)說(shuō)明其原理。很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼β-半乳糖苷酶N-端的146個(gè)氨基酸，稱為α-肽，載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZ基因型，它表達(dá)β-半乳糖苷酶的C-端肽鏈，當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal變?yōu)樗{(lán)色化合物，這就是所謂的α-互補(bǔ)，而重組子由于基因插入使α-肽基因失活，不能形成α-互補(bǔ)，在含X-gal的平板上，含陽(yáng)性重組子的細(xì)菌為無(wú)色菌落。P163/175最后一段P165/177圖5.2.3P1775.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，因此也稱為基因的體外擴(kuò)增法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的目的DNA或某一特定的DNA片段擴(kuò)增十萬(wàn)乃到上千萬(wàn)倍，無(wú)需通過(guò)繁瑣的基因克降測(cè)序，便可得到足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝，因此也被稱為無(wú)細(xì)胞分子克隆。5.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)PCR反應(yīng)的模板DNA若是基因組上的某個(gè)片段，就稱為genomicPCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱為RT-PCR。（P165/177）P165/177圖5-9聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)原理示意圖P177圖5-10PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較P17894℃加熱，淬火降低反應(yīng)溫度（退火，約50℃），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。50℃~60℃，退火引物與模板DNA相結(jié)合將反應(yīng)混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。PCR擴(kuò)增，72℃左右,按每分鐘1000個(gè)堿基對(duì)設(shè)計(jì)循環(huán)往復(fù)其應(yīng)用主要是以下幾個(gè)方面：（1）基因克??；DNA測(cè)序；分析突變；基因重組與融合；檢測(cè)基因的修飾；鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的DNA序列；轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的繪圖；合成基因的構(gòu)建；構(gòu)建克隆或表達(dá)載體；檢測(cè)某基因的內(nèi)切酶多態(tài)性等。（2）臨床診斷細(xì)菌、病毒、螺旋體、支原體、衣原體、立克次氏體、分枝桿菌等病原體的鑒定；人類遺傳病的鑒定；診斷遺傳疾患；監(jiān)測(cè)臨床標(biāo)本中病原體的核酸序列；對(duì)法醫(yī)學(xué)標(biāo)本做遺傳學(xué)鑒定；分析激活癌基因中的突變情況；生成克隆化雙鏈DNA中的特異序列作為探針。PCR相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用問(wèn)題：PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制有哪些主要的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)相同點(diǎn)：反應(yīng)的底物都是dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)都需要DNA聚合酶的催化，而且鏈的延伸都只能是5`——3`方向；都需要模板，都按半保留復(fù)制機(jī)理進(jìn)行；都需要引物；都需要Mg2+不同點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制，而PCR中，DNA是連續(xù)復(fù)制；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，不需要將雙鏈完全解開形成單鏈，按半不連續(xù)方式進(jìn)行DNA的復(fù)制。而PCR反應(yīng)中，DNA雙鏈必須完全解鏈，復(fù)制過(guò)程都是連續(xù)進(jìn)行的。細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，DNA的解鏈通過(guò)解鏈酶催化，而PCR反應(yīng)中是通過(guò)高溫使雙鏈解離；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，引物是通過(guò)RNA聚合酶合成的RNA鏈，而PCR反應(yīng)中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，溫度保持一致，而PCR反應(yīng)中，溫度在解鏈溫度、退火、延伸3個(gè)溫度之間變化。5.2.4實(shí)時(shí)定量PCRP178（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，擴(kuò)增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量不準(zhǔn)確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測(cè)PCR儀繪制DNA擴(kuò)增過(guò)程中的累積速率動(dòng)態(tài)變化圖，基本消除在測(cè)定終端產(chǎn)物豐度時(shí)變異系數(shù)較大的問(wèn)題。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在帶透明蓋的塑料小管中進(jìn)行,激發(fā)光可以直接透過(guò)管蓋,使其中的熒光探針被激發(fā).熒光探針事先混合在PCR反應(yīng)液中,只有與DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結(jié)合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加。最簡(jiǎn)單的DNA結(jié)合的熒光探針是非序列特異性熒光染料SYBRGreenI,激發(fā)光波長(zhǎng)520nm,這種熒光染料只能與雙鏈DNA結(jié)合,并且只有在與DNA結(jié)合時(shí),才能被激發(fā)產(chǎn)生熒光。SYBRGreenI作探針的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖示利用SYBRGreenI可以檢測(cè)PCR反應(yīng)中獲得的全部雙鏈DNA,但是不能區(qū)分不同的雙鏈DNA.為確保熒光檢測(cè)的確實(shí)是靶DNA，又設(shè)計(jì)了僅能與目的DNA特異結(jié)合的熒光探針,如TaqMan探針。TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA，長(zhǎng)50bp-150bp，該DNA的5’和3’端帶有短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)兩個(gè)不同熒光基團(tuán)，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測(cè)不到熒光。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，TaqMan探針結(jié)合到目的DNA序列上，并且會(huì)被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個(gè)切除而降解。切下來(lái)的熒光基團(tuán)解除了熒光淬滅的束縛，會(huì)在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反映了所擴(kuò)增靶DNA的總量。TaqMan探針具有三個(gè)要素：一端的短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)（菱形）一段目的DNA特異的堿基序列另一端的長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光基團(tuán)（小圓形）P179圖5-12TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過(guò)設(shè)定閾值時(shí)，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品中待檢測(cè)靶DNA的絕對(duì)含量。

圖5-11用實(shí)時(shí)定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對(duì)表達(dá)量。對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。5.2.5基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建P183

為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無(wú)法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫(kù)，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來(lái)，最后分離得到目的基因。5.2.5基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€(gè)序列至少有一個(gè)代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫(kù)。基因組DNA文庫(kù)的用途：P183第二段用于分離特定的基因片段分析特定基因結(jié)構(gòu)研究基因表達(dá)調(diào)控用于全基因組物理圖譜的構(gòu)建和全基因組序列測(cè)定等構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)的步驟

P183最后一段（1）第一步是制備大小合適的隨機(jī)DNA片段（2）在體外將這些DNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體相連成重組子（3）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或其他受體細(xì)胞中（4）從轉(zhuǎn)化子克隆群中篩選取出含有靶基因的克隆為保證能從基因組文庫(kù)中篩選到某個(gè)特定基因，基因組文庫(kù)必須具有一定的代表性和隨機(jī)性。也就是說(shuō)文庫(kù)中全部克隆所攜帶的DNA片段必須覆蓋整個(gè)基因組。在文庫(kù)構(gòu)建中通常采用兩種策略提高文庫(kù)代表性：一是用機(jī)械切割法或限制性內(nèi)切核酸酶切割法隨機(jī)斷裂DNA，以保證克隆的隨機(jī)性。二是增加文庫(kù)重組克隆的數(shù)目，以提高覆蓋基因組的倍數(shù)。P183最后一段預(yù)測(cè)一個(gè)完整基因組文庫(kù)應(yīng)包含的克隆數(shù)目，可用Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一個(gè)基因組文庫(kù)所應(yīng)該包含的重組克隆數(shù)目；p表示所期望的靶基因在文庫(kù)中出現(xiàn)的概率；f表示重組克隆平均插入片段的長(zhǎng)度與基因組DNA總長(zhǎng)的比值。為獲得整個(gè)基因簇或一個(gè)基因及其兩翼延伸序列，基因組文庫(kù)中的DNA片段常大于20kb。以人為例，其基因組大小為3×109bp若p=99%，平均插入片段大小為20kb，則N=6.7×105。P183構(gòu)建基因組文庫(kù)最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15—20kb）和限制性內(nèi)切酶部分消化法（P184第三段）。例如用識(shí)別4個(gè)核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A，與BamHI是一對(duì)同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產(chǎn)生的DNA片段可插入到經(jīng)BamHI消化的λ噬菌體載體上?；玖鞒倘鏟184圖5-17圖5-13用Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的過(guò)程圖示。

λ噬菌體作為克隆載體噬菌體文庫(kù)構(gòu)建方法簡(jiǎn)單高效，所獲得的文庫(kù)易于用分子雜交法進(jìn)行篩選，因此被廣泛用于細(xì)菌、真菌等基因組較小物種的研究。P184最后一段此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。它們的優(yōu)點(diǎn)是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復(fù)制的過(guò)程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。操作也相對(duì)較困難。P185第一段建立一個(gè)基因文庫(kù)后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克?。?）抗生素抗性基因插入失活法（2）β-半乳糖苷酶基因插入失活法（3）放射性標(biāo)記核酸探針雜交法（通過(guò)與放射性標(biāo)記的探針雜交后，進(jìn)行放射自顯影能夠確定攜帶外源DNA的重組體）（1）抗生素抗性基因插入失活法很多質(zhì)粒載體都帶有一個(gè)或多個(gè)抗生素抗性基因標(biāo)記，在這些抗藥性基因內(nèi)有酶的識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)用某種限制酶消化并在該位點(diǎn)插入外源目的DNA后，抗藥性基因不再被表達(dá)，稱為基因插入失活，因此，當(dāng)此插入外源DNA的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主菌并在藥物選擇平板上培養(yǎng)時(shí)，對(duì)該藥物由抗性轉(zhuǎn)為敏感，便可篩選出攜帶目的DNA的克隆。5.3RNA基本操作技術(shù)P185P189第一段細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%總RNA的提取P185這些RNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是rRNA電泳后的3條特征性條帶28S、18S和5S是鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。由于mRNA呈單鏈，容易受核酸酶的攻擊，對(duì)RNA的操作要求比DNA操作更嚴(yán)格，操作時(shí)必須設(shè)置專門的處理方法，以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境、所用器皿及溶液均沒(méi)有RNA酶的污染。總RNA的抽提方法有多種，目前實(shí)驗(yàn)室常用的方法是用異硫氰酸胍-苯酚抽提法。見185第四段RNA的濃度和純度可以通過(guò)測(cè)定其OD260和OD280來(lái)判斷。OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染，則OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。mRNA的純化P186真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5`端帽子結(jié)構(gòu)和3`端的polyA尾巴，這種polyA結(jié)構(gòu)為真核生物mRNA的的提取提供極為方便的選擇性標(biāo)記志，實(shí)驗(yàn)中常用寡聚（dT）-纖維素柱色譜法獲得高純度mRNA.該方法利用mRNA3`端含有PolyA+的特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過(guò)兩寡聚dT纖維柱后可和到較高純度的mRNA.P173:圖5-14cDNA文庫(kù)的載體選擇要根據(jù)該文庫(kù)的用途來(lái)確定基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過(guò)程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等?；蛭膸?kù)的篩選P1891、核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫(kù)篩選中最常用的一種方法，用放射性標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當(dāng)溫育。同時(shí)保留原來(lái)的菌落平板作對(duì)照。取出已經(jīng)長(zhǎng)有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì)，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過(guò)放射性自顯影顯示雜交結(jié)果。通過(guò)對(duì)應(yīng)于平板上的位置找到相應(yīng)克隆。圖5-17通過(guò)核酸雜交篩選目的克隆流程圖2、PCR篩選法將整個(gè)文庫(kù)（以質(zhì)粒的形式或者細(xì)菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計(jì)好的目的基因探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽(yáng)性的孔，把每個(gè)陽(yáng)性孔中的克隆再稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行PCR篩選。重復(fù)以上程序，直到鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個(gè)克隆為止。3、免疫篩選法該法僅適用于對(duì)表達(dá)文庫(kù)的篩選。若實(shí)驗(yàn)中靶基因的序列完全未知但是有針對(duì)該基因產(chǎn)物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法。圖5-18噬菌體表達(dá)文庫(kù)的免疫化學(xué)篩選法示意圖

P192：---4基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)在構(gòu)建原理和用途上的主要區(qū)別是什么？cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的差別cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA。以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫(kù)。基因組文庫(kù)指的是將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段的集合，它包含了該生物的所有基因。cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的差別差別基因組文中包含了所有的基因，而cDNA文庫(kù)只包含表達(dá)的基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列，因此在研究基因結(jié)構(gòu)時(shí)沒(méi)有多大用處。cDNA文庫(kù)代表了mRNA的來(lái)源，其中一些特定的轉(zhuǎn)錄本豐富而另一些很少，所以存在豐度的差別；而基因組文庫(kù)在理論上均等地代表了所有基因序列。從不同細(xì)胞類型制備的cDNA文庫(kù)包含一些共同序列和獨(dú)特序列，可用于分離差別表達(dá)的基因；基因組文庫(kù)中不能?；蚪M文庫(kù)由于含有不表達(dá)序列，因此比cDNA文庫(kù)大。mRNA在不同的組織之間存在豐度的差異，因此cDNA文庫(kù)的構(gòu)建對(duì)于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫(kù)不存在這樣的問(wèn)題。5.5基因克?。╟lone）技術(shù)5.5.1cDNA文庫(kù)差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達(dá)基因的方法，例如對(duì)于兩種不同的組織細(xì)胞，先提取它們的poly(A)+mRNA，分別構(gòu)建這兩種組織的cDNA文庫(kù)，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標(biāo)記的cDNA探針，再用這兩種探針?lè)謩e與一類cDNA文庫(kù)的兩套重復(fù)考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細(xì)胞中都表達(dá)的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細(xì)胞中特異表達(dá)的mRNA,再對(duì)這樣的克隆進(jìn)行測(cè)序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達(dá)的基因。5.5.2cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)

5.5.3Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)后基因組時(shí)代的需要推動(dòng)此技術(shù)的產(chǎn)生。Gateway基因大規(guī)模克隆法利用λ噬菌體進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNA片段重組，不需要傳統(tǒng)的酶切連接過(guò)程，基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移，為大規(guī)模克隆基因組注釋的開放讀碼框提供了有力的技術(shù)平臺(tái)。Gateway大規(guī)模克隆策略主要包括TOPO反應(yīng)和LR反應(yīng)TOPO反應(yīng):將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體。載體上的CCCTT被拓?fù)洚悩?gòu)酶所識(shí)別，通過(guò)與切口處的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，將該酶偶聯(lián)在載體上。5’GTGG粘性末端攻擊PCR產(chǎn)物的互補(bǔ)性末端并與接頭序列CACC退火，使PCR產(chǎn)物以正確方向連入Entry載體。LR反應(yīng)：將目的片段從Entry載體中重組入表達(dá)載體。Entry載體上基因兩端具有attL1和attL2位點(diǎn)，目的載體上含有attR1和attR2位點(diǎn)，在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點(diǎn)attB1和attB2，將目的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中。5.5.4基因的圖位克隆法（Map-basedcloning）是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說(shuō)，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過(guò)該方法克隆得到。圖5-26染色體步移法克隆基因示意圖在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來(lái)計(jì)算的，1cM（厘摩）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cM≈1000kb；擬南芥中，1cM≈290kb；小麥中，1cM≈3500kb。用圖位克隆法獲得水稻脆桿基因BCl

將BCl定位于水稻3號(hào)染色體（Chr3）分子標(biāo)記C524a和RM16之間；B.覆蓋BCl位點(diǎn)的BAC大片段。C.BCl位點(diǎn)的精細(xì)定位。BCl位點(diǎn)被定位于分子標(biāo)記P2和P4之間與P3共分離。D.BCl基因結(jié)構(gòu)。紅色為編碼區(qū)，白色為5’和3’非翻譯區(qū)，黑色線段為內(nèi)含子。bcl-1和bcl-2表示兩個(gè)突變位點(diǎn)。

5.6蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)由于蛋白質(zhì)分離（雙向電泳和高效液相層析技術(shù)）和鑒定技術(shù)（現(xiàn)代質(zhì)譜）的進(jìn)步，以及基因組學(xué)和生物信息學(xué)的交叉滲透，蛋白質(zhì)組學(xué)研究在已經(jīng)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展。

5.6.1原理：蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同pH緩沖液中表現(xiàn)出不同的帶電性，因此，在兩性電解質(zhì)電泳體系中，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)會(huì)聚集在介質(zhì)上不同的區(qū)域（等電點(diǎn)）從而被分離。蛋白質(zhì)的分子量決定了SDS-蛋白復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率，因?yàn)榫郾０纺z中的SDS帶有大量的負(fù)電荷，與之相比，蛋白質(zhì)所帶電荷量可忽略不計(jì)。因此，蛋白質(zhì)在SDS凝膠電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)速度和距離完全取決于其分子量。5.6.2蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlotting）20世紀(jì)70年代末80年代初在蛋白質(zhì)凝膠電泳和固相免疫測(cè)定基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，為檢測(cè)樣品中是否存在蛋白抗原提供了一種可靠的方法。是分子生物學(xué)中最常用的蛋白質(zhì)技術(shù)。原理根據(jù)被測(cè)蛋白能與特異抗體結(jié)合的特性和該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。免疫印跡（WesternBlotting）示意圖.5.6.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)意義：蛋白質(zhì)組學(xué)的重要檢測(cè)和鑒定技術(shù)。特點(diǎn)：是一種超靈敏的鑒定技術(shù)。錯(cuò)誤率低于百萬(wàn)分之一。種類：基質(zhì)輔助的激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-AssistedLaserDesorptionIonizationTime-Of-Flightspectrometry，MALDI-TOF）和電噴霧質(zhì)譜（Electrosprayionisation，ESI-MS）?，F(xiàn)行質(zhì)譜儀主要有三個(gè)連續(xù)的組成部分，即離子源，離子分離區(qū)和檢測(cè)器。圖5-31MALDI–TOF分子質(zhì)譜儀原理圖對(duì)限制性內(nèi)切酶的作用，下列哪個(gè)不正確——A.識(shí)別序列長(zhǎng)度一般為4~6bpB.只能識(shí)別和切割原核生物DNA分子C.識(shí)別序列具有回文結(jié)構(gòu)