等位基因特異性PCR原理和應(yīng)用-2015116-

等位基因特異性PCR的原理與應(yīng)用2015.1.16內(nèi)容概要基本原理實(shí)驗(yàn)方法臨檢項(xiàng)目—KRAS、EGFR突變檢測(cè)科研應(yīng)用—BSG位點(diǎn)分型等位基因特異性PCR的基本原理單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)方法限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）變性高效液相色譜（DHPLC）異源雙鏈分析（HA）基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交（DASH）基因芯片法TaqMan探針技術(shù)焦磷酸測(cè)序法……？操作繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)產(chǎn)物污染靈敏度低儀器昂貴等位基因特異性PCR等位基因特異性PCR（AlleleSpecific-PCR，AS-PCR）又稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR（AmplificationRefractoryMutationSystem-PCR，ARMS-PCR）PCR擴(kuò)增過(guò)程中，引物從3’末端開始延伸，要求3’端堿基與模板完全配對(duì)等位基因特異性PCR基本原理YouF.M.2008,BMCBioinformaticsTwoAllele-Specific(AS)primers,oneforeachalleleofaSNParedesigned.TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3'end.Twosetsofprimers,eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned.IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction,thereactioniscalledallele-specificPCR(AS-PCR).四引物法ARMS-PCR單管反應(yīng)凝膠電泳耗時(shí)長(zhǎng)開管操作易污染缺陷：使用熒光定量PCR檢測(cè)realtimePCR速度快閉管操作不易污染等位基因特異性PCR技術(shù)特點(diǎn)靈敏度高（0.1-1%）操作簡(jiǎn)便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如FFPE）精確突變類型方法建立需時(shí)較長(zhǎng)僅能檢測(cè)已知突變適用于臨床檢驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)測(cè)序法與等位基因特異性PCR法比較Sanger測(cè)序法焦磷酸測(cè)序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率低較高高商用試劑盒無(wú)有有流程與速度1-2天2-3天<1天數(shù)據(jù)分析要求高高低試劑成本低低略高儀器成本高高低等位基因特異性PCR的

實(shí)驗(yàn)方法操作流程及數(shù)據(jù)解讀實(shí)驗(yàn)操作收到樣本之后：試劑盒（以友芝友EGFR試劑盒為例）編號(hào)位點(diǎn)內(nèi)容規(guī)格1G719XPCR緩沖液、G719X引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl2S768IPCR緩沖液、S768I引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl3T790MPCR緩沖液、T790M引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl4L858RPCR緩沖液、L858R引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl5L861QPCR緩沖液、L861Q引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl6INSPCR緩沖液、Ins引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl7DELPCR緩沖液、Del引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl8質(zhì)控（外控）PCR緩沖液、質(zhì)控引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl突變探針：FAM熒光標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)探針：VIC熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增ABI7500開機(jī)，儀器自檢；將準(zhǔn)備好的8連管放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序；信號(hào)采集：EGFR基因：FAM通道；內(nèi)標(biāo)：VIC通道；PCR反應(yīng)條件：37℃：10分鐘95℃：5分鐘95℃：15秒60℃：60秒核酸擴(kuò)增區(qū)40循環(huán)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照（空白對(duì)照）

應(yīng)無(wú)FAM熒光信號(hào)產(chǎn)生，或Ct值≥38

陽(yáng)性對(duì)照（弱陽(yáng)性對(duì)照）FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值<38，但可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動(dòng)。無(wú)DNA污染驗(yàn)證PCR有效性樣品的外控和內(nèi)控待測(cè)樣品的外控（8號(hào)管FAM信號(hào)曲線）應(yīng)有FAM信號(hào)以友芝友試劑盒為例：FAM通道23≤Ct值≤30；待測(cè)樣品的內(nèi)控（1-7號(hào)管的HEX/VIC/JOE信號(hào)曲線）應(yīng)有擴(kuò)增曲線以友芝友試劑盒為例：樣品檢測(cè)中VIC通道Ct值<38。Ct<23：DNA加入過(guò)量30<Ct<34：DNA加入量較低Ct≥34：需重新制備樣本結(jié)果判定反應(yīng)液突變類型陰性陰性陽(yáng)性Ct值Ct值ΔCt值Ct值ΔCt值G719XPCR反應(yīng)液G719XCt>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥9Ct≤38<9S768IPCR反應(yīng)液S768I

Ct>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥8Ct≤38<8T790MPCR反應(yīng)液T790MCt>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥8Ct≤38<8L858RPCR反應(yīng)液L858RCt>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7L861QPCR反應(yīng)液L861QCt>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7InsPCR反應(yīng)液插入Ct>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7DelPCR反應(yīng)液缺失Ct>38或無(wú)Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7ΔCt=突變檢測(cè)Ct–內(nèi)控檢測(cè)Ct以友芝友EGFR試劑盒為例臨檢項(xiàng)目—KRASKRAS背景KRAS是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于12號(hào)染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直腸癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者KarapetisCS,2008,NEngJMed結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；美國(guó)FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說(shuō)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國(guó)衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）》。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤K-ras基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。KRAS突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗。KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）AndersonSM,2011,ExpertRev.Mol.DiagnEberhardDA,2005,JClinOncol非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。KRAS主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于codon12(80%)、codon13(15-20%)、codon61和146(<5%)；在肺癌中，約97%的KRAS突變發(fā)生于codon12、13，其余位于codon61和146。突變密碼子堿基變化CosmicIDGly12Asp12GGT＞GAT521Gly12Val12GGT＞GTT520Gly12Ala12GGT＞GCT522Gly12Ser12GGT＞AGT517Gly12Cys12GGT＞TGT516Gly12Arg12GGT＞CGT518Gly13Asp13GGC＞GAC532擬開發(fā)產(chǎn)品特異性引物：7條

（已驗(yàn)證特異性）參照引物：1條

（已驗(yàn)證特異性）下游引物：1條

（已驗(yàn)證特異性）Taqman探針：1條

（已設(shè)計(jì)，待訂購(gòu)）鎖核酸阻滯探針：1條（已設(shè)計(jì)，待訂購(gòu)）陽(yáng)性對(duì)照：包含7種突變的質(zhì)粒DNA模板（已制備并測(cè)序）Taq酶，最好為TaqGold（hotstartenzyme)qPCR混合反應(yīng)液項(xiàng)目進(jìn)展-KRAS第二批引物能較好區(qū)分質(zhì)粒DNA突變（SYBRgreen染料，ABI7500）模板引物Cт516516P24.03719517516PUndetermined518516PUndetermined520516PUndetermined521516P36.00975522516P38.87938532516P39.47913WT516PUndetermined陰參516PUndetermined模板引物Cт516517PUndetermined517517P23.0278518517PUndetermined520517PUndetermined521517PUndetermined522517PUndetermined532517PUndeterminedWT517PUndetermined陰參517PUndetermined516位突變517位突變項(xiàng)目進(jìn)展-KRAS模板引物Cт516532P36.52584517532P36.80177518532P36.39018520532P37.23503521532P36.97367522532P37.01616532532P16.01479WT532P31.0284陰參532PUndetermined模板引物Cт516CP19.89434517CP19.90041518CP19.23109520CP19.56911521CP18.96716522CP18.51238532CP18.76427WTCP19.11962陰參CPUndetermined532位突變參照引物臨檢項(xiàng)目—EGFR檢測(cè)EGFR突變背景EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)基因位于染色體7p11.2，大小192kb，是上皮生長(zhǎng)因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼、厄洛替尼的療效密切有關(guān)。其中EGFR突變的患者對(duì)吉非替尼、厄洛替尼治療敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。EGFR酪氨酸激酶上外顯子18-21為最常見的基因突變位點(diǎn)，也是靶向藥物吉非替尼結(jié)合的位點(diǎn)，外顯子19缺失和外顯子21的L858R突變是最常見的與吉非替尼療效相關(guān)的敏感突變。EGFR突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。MokT.S.2009,NEngJMedMaemondoM.2010,NEngJMedEGFR突變檢測(cè)相關(guān)指南美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2011版的癌癥治療指南中明確指出：EGFR突變，尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變，與腫瘤對(duì)TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系。而部分EGFR-TKI初始治療有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐藥，與EGFR外顯子20突變密切相關(guān)。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）在JCO上發(fā)表報(bào)告：EGFR-TKI是攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌病人的一線治療藥物，有益于進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療。歐洲EMEA指出：易瑞沙（吉非替尼）僅對(duì)攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌患者有效，平均無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)3.5月。美國(guó)FDA（2013）批準(zhǔn)對(duì)擬采用阿法替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治療的患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)的試劑盒（therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas?EGFRMutationTest）；我國(guó)《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》中也明確指出EGFR突變，尤其是19號(hào)外顯子缺失突變與腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的敏感度有重要關(guān)系；對(duì)腺癌、大細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等肺癌組織學(xué)類型，EGFR檢測(cè)為一類推薦。EGFR突變位點(diǎn)（常規(guī)檢測(cè)29個(gè)）突變外顯子堿基變化CosmicIDG719A182156G>C6239G719S182155G>A6252G719C182155G>T6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753>S192240-2257del1812370E746-A750>I192235-2252>AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750>A192237-2251del1512678E746-S752>A192237-2254del1812367E746-S752>V192237-2250>T(complex)12384E746-S752>D192238-2255del186220L747-A750>P192238-2248>GC(complex)12422L747-T751>Q192238-2252>GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750>P192239-2248TTAAGAGAAG>C12382L747-P753>Q192239-2258>CA(complex)12387L747-T751>S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751>P192239-2251>C(complex)12383T790M202369C>T6240S768I202303G>T6241V769-D770insASV202307-2308insGCC