發(fā)酵工業(yè)菌種

第2章發(fā)酵工業(yè)菌種在發(fā)酵工業(yè)中，工業(yè)生產(chǎn)水平主要由三個要素決定，即：

1、生產(chǎn)菌種性能

2、發(fā)酵及提取工藝條件

3、生產(chǎn)設(shè)備

其中，生產(chǎn)菌種是最重要的因素，是發(fā)酵的靈魂。2.1發(fā)酵工業(yè)常用菌種2.1.1發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求（1）菌種不能是病源菌（2）發(fā)酵周期短，生產(chǎn)能力強（3）發(fā)酵過程中不產(chǎn)或少產(chǎn)與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)相似的副產(chǎn)物（4）原料來源廣價格低廉，菌種能高效地將原料轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品（5）對需添加的前體有耐受能力，且不能將前體作為一般碳源利用菌種純，遺傳性能穩(wěn)定，不易變異退化可以在易于控制的條件下發(fā)酵2.1.2發(fā)酵工業(yè)常用菌種（1）細(xì)菌自然界分布最廣、數(shù)量最多的一類微生物，單細(xì)胞原核生物。

①工業(yè)常用的有枯草桿菌、短桿菌②還常用作基因工程載體的宿主細(xì)胞，用于構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)外源物質(zhì)。（2）酵母菌單細(xì)胞真核生物，主要分布于含糖較多的酸性環(huán)境中如水果、蔬菜、花蜜和植物葉子上，以及果園土壤中。常用的有啤酒酵母、酒精酵母。釀酒酵母假絲酵母紅酵母（3）霉菌是一群在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀、絮狀菌絲真菌的通稱。分布于偏酸性環(huán)境中，常用的有根霉、毛霉、青霉等根霉曲霉青霉（4）放線菌因其菌落呈放射狀而得名。屬原核微生物類群。分布于有機質(zhì)豐富的微堿性環(huán)境中，大多腐生，少數(shù)寄生

。最大價值在于能生產(chǎn)多種抗生素，從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素有60%以上的是來自于放線菌。常用的有鏈霉菌屬、小單孢屬等。（5）其它類①藥用真菌：如靈芝、茯苓、冬蟲夏草等②藻類：如螺旋藻2.2發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選符合發(fā)酵工業(yè)要求的菌種可從如下途徑獲得：

1從自然界分離篩選

2從菌種保存機構(gòu)直接購買所需的菌株

3從生產(chǎn)過程中發(fā)酵水平高的批號中重新進(jìn)行分篩獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實現(xiàn)高水平發(fā)酵工程工業(yè)生產(chǎn)的第一環(huán)節(jié)。菌種分離：將混雜著各種微生物的樣品按照實際需要和菌株特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需的微生物的過程。

從自然界分離篩選菌種的一般步驟：樣品采集樣品預(yù)處理富集培養(yǎng)菌種分離初篩、復(fù)篩

性能鑒定

2.2.1樣品采集總原則是：（1）

樣品來源越廣，獲得新菌種的可能性越大；（2）要了解目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和可能產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的微生物種類及其生理特征。

①了解微生物的代謝規(guī)律。如初級代謝基本相同，但通常絲狀菌及產(chǎn)芽孢細(xì)菌才能進(jìn)行次級代謝。②考慮微生物的生理特征。如營養(yǎng)類型、生長環(huán)境等。1土樣選擇如酵母菌果園產(chǎn)蛋白酶菌魚、肉加工廠高溫酶產(chǎn)生菌火山或溫泉

耐壓菌油井或海洋深處采樣深度

離地表5-25cm處較好。季節(jié)條件

避免雨季，一般以秋季最理想。采樣方法

用無菌器具按規(guī)范取樣，記錄采樣地點、時間、環(huán)境情況等以備考證。2.2.2樣品的預(yù)處理

預(yù)處理可提高菌種的分離效率，常使用的方法有：（1）物理方法：

熱處理：常用來減少樣品中的細(xì)菌數(shù)。

膜過濾和離心法：用來濃縮水中的微生物細(xì)胞。（2）化學(xué)方法：在培養(yǎng)基中添加某些化學(xué)成分來增加特定微生物數(shù)量。①②（3）誘餌法：

將一些固體物質(zhì)加到待分離的土壤或水中做成誘餌富集目的菌。2.2.3富集培養(yǎng)

利用不同微生物生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)的要求不同，投其所好取其所抗，使目的菌成為人工環(huán)境下的優(yōu)勢菌。（1）控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：如唯一碳源（2）控制培養(yǎng)條件：如T、DO、pH、添加抑制劑等2.2.4菌種分離

常用的純培養(yǎng)分離方法有：（1）平板劃線法（2）稀釋分離法（3）簡單平板分離法（4）涂布分離法（5）毛細(xì)管分離法（6）小滴分離法通常某些菌種在分離時就可進(jìn)行篩選，一般這些菌在平板上培養(yǎng)時，其產(chǎn)物可與指示劑、顯色劑或底物等反應(yīng)而直接定性地鑒定。

常用的平板快速檢測法有：（1）透明圈法

分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈與菌落直徑比的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力。土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后制備成菌懸液涂布在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因為在深層培養(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。但作為初篩的手段是有意義的對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使目的微生物菌落周圍呈現(xiàn)變色圈，從而能被快速鑒別出來。（2）變色圈法用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌甘油三丁酸酯為底物羅丹明B為指示劑熒光圈又如分離解脂微生物豆油作底物中性紅（紅～黃.6.8～8.0.）指示菌落周圍呈紅色圈（3）生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌指示菌（工具菌）是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株將待檢菌涂布于高濃度工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌（4）抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈指示菌采用抗生素的敏感菌2.2.5菌種的初篩和復(fù)篩

目的是選擇產(chǎn)物合成能力較高的菌株。并不是所有菌種都能利用平板快速檢測法鑒定，因此就要使用常規(guī)的生產(chǎn)性能鑒定，即初篩和復(fù)篩。

（1）初篩：以量多為原則（2）復(fù)篩：結(jié)合生產(chǎn)工藝條件2.3性能鑒定

（1）確定菌種類型（2）測定一系列生產(chǎn)指標(biāo)，包括菌種毒性試驗和生產(chǎn)性能鑒定。

常用的鑒定菌種的方法有：（1）經(jīng)典的分類鑒定法（細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性）（2）現(xiàn)代分類鑒定法（遺傳型的鑒定、細(xì)胞化學(xué)成分等）（3）將菌種送到權(quán)威機構(gòu)鑒定2.4發(fā)酵工業(yè)菌種改良

2.4.1

菌種改良目的

1提高產(chǎn)物產(chǎn)量

2提高產(chǎn)物純度，減少副產(chǎn)物

3改良菌種性能，改善發(fā)酵過程

4改變生物合成途徑，獲得高新產(chǎn)品2.4.2菌種改良的方法1自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用微生物的自然突變而進(jìn)行菌種篩選的過程。

引起自然突變的因素：（1）多因素低劑量的誘變效應(yīng)（2）互變異構(gòu)效應(yīng)2、誘變育種

人工采用物理、化學(xué)和生物的方法促使微生物發(fā)生突變的育種手段。（1）選擇出發(fā)菌株：原則是要對誘變劑的敏感性強，變異幅度大，產(chǎn)量高（2）同步培養(yǎng)：使生理狀態(tài)一致（3）制備單細(xì)胞或單孢子菌懸液：能均勻接觸誘變劑（4）誘變處理：誘變劑種類、劑量大小、處理時間（5）篩選變異菌株：①平板快速檢測法②形態(tài)變異的利用③高通量篩選3、雜交育種

微生物雜交的本質(zhì)是基因重組。4、原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合和雜交育種都是在細(xì)胞水平上的操作。原生質(zhì)體融合可以在種間、種內(nèi)、屬間發(fā)生。5、基因工程育種2.5發(fā)酵工業(yè)菌種保藏2.5.1菌種變異及退化機理一、菌種退化指生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良菌種，由于進(jìn)行接種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。1、退化表現(xiàn)：2、退化原因：

從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。（1）基因突變：根本原因（2）連續(xù)傳代：直接原因3、防止菌種退化的措施（1）減少傳代次數(shù)（2）選擇合適的培養(yǎng)條件（3）利用不易衰退的細(xì)胞傳代（4）采用有效的菌種保藏方法二、退化菌種的復(fù)壯1、純種分離法2、淘汰退化的個體2.5.2菌種保藏技術(shù)一、菌種保藏原理

采用低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)等手段使微生物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。二、常用的菌種保藏方法1、斜面低溫保藏法（定期移植保藏法）①方法：②原理：低溫③適用范圍：各類微生物④保存期限：不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌每月需移植一次產(chǎn)芽孢的細(xì)菌3個月移植一次

酵母、霉菌、放線菌3—6個月移植一次⑤優(yōu)點：方法簡便，便于操作⑥缺點：保存時間短，變異退化幾率大2、液體石蠟覆蓋保藏法①方法：②原理：低溫、缺氧③適用范圍：酵母、霉菌、放線菌和好氣性細(xì)菌④保存期限：不同種類M保藏期限不同，一般為

1—10年⑤優(yōu)點：方法簡單，不需特殊設(shè)備，保藏期限相對較長⑥缺點：對厭氧菌及可分解利用烴類的M保藏效果較差3、砂土管保藏法①方法：制備砂土管制備斜面培養(yǎng)物制備菌懸液干燥保藏②原理：低溫、缺氧、干燥、缺營養(yǎng)③適用范圍：耐干燥的菌種，如細(xì)菌芽孢、放線菌及真菌孢子④保存期限：幾年—幾十年⑤優(yōu)點：簡單易行，保藏時間長⑥缺點：工作量大，費人力，對干燥敏感的

M不適用4、冷凍干燥保藏法①方法：選擇和制備保護(hù)劑準(zhǔn)備菌種和菌液

預(yù)凍冷凍干燥

保藏②原理：低溫、缺氧、干燥③適用范圍：除某些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌，其他各類M均可采用④保存期限：一般可達(dá)10年以上⑤優(yōu)點：保存期長、變異小、適用范圍廣、存活率高，大多數(shù)專業(yè)保藏機構(gòu)采用⑥缺點：需要專業(yè)設(shè)備，操作過程相對復(fù)雜5、液氮超低溫保藏法①方法：準(zhǔn)備安瓿管制備菌懸液分裝和熔封安瓿管冷凍保藏復(fù)活②原理：超低溫，M的