細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)注意事項(xiàng)與誤差分析

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)注意事項(xiàng)與誤差分析董光宴工程師一、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)二、影響試驗(yàn)結(jié)果的因素分析湛江博康海洋生物有限公司2/1/20231博康一、試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

——2010年版《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》P310細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

實(shí)驗(yàn)前，須用肥皂洗手，用75％酒精棉球消毒。在使用洗耳球、移液管取樣時，應(yīng)注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內(nèi)毒素進(jìn)入供試液。復(fù)溶0.5ml鱟試劑時，在旋渦混合器上點(diǎn)擊1～3秒，促進(jìn)鱟試劑的溶解。2/1/20232博康由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過程中及觀察結(jié)果時應(yīng)注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時，標(biāo)準(zhǔn)對照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時進(jìn)行，并使用同一支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。2/1/20233博康在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實(shí)驗(yàn)中要求的對照應(yīng)同時進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計算和判斷。在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實(shí)驗(yàn)中要求的對照應(yīng)同時進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計算和判斷。2/1/20234博康二、影響試驗(yàn)結(jié)果的因素分析鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水環(huán)境實(shí)驗(yàn)器皿實(shí)驗(yàn)人員樣品試驗(yàn)2/1/20235博康1鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：WS1-363（B-123）-91

性狀、鑒別、檢查、靈敏度測定、用途、規(guī)格、貯藏應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)：干擾能力、穩(wěn)定性國外標(biāo)準(zhǔn)：無菌2/1/20236博康1鱟試劑靈敏度：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示?！?010版《中國藥典》國外鱟試劑：靈敏度由FDA統(tǒng)一標(biāo)定2/1/20237博康1鱟試劑鱟試劑靈敏度復(fù)核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確，也是考查檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。因此要求每個實(shí)驗(yàn)室在使用一批新的鱟試劑進(jìn)行供試品干擾實(shí)驗(yàn)或供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查前必須進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。——2010版《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》2/1/20238博康1鱟試劑外觀：本品為白色或類白色凍干塊或粉末，在水和生理鹽水中易溶。干擾能力：指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。鱟試劑參考品：150603-201003，2.2ml/0.06EU

2/1/20239博康2細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯誤使用

2/1/202310博康1）細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類細(xì)菌內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品（IS2，94/580）細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（200707）細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（200758-201174）國外內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：國標(biāo)、工作品

2/1/202311博康2）細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用途細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對照。——2010年版《中國藥典》2/1/202312博康3）細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當(dāng)λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度?！痹囼?yàn)結(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。2/1/202313博康4）內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)?！?010年版《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》正確（易折點(diǎn)）錯誤2/1/202314博康注意：①只能在安瓿的易折點(diǎn)上部開啟內(nèi)毒素，不能沿易折點(diǎn)開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。②只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。③若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，為一次性使用。2/1/202315博康5）錯誤使用使用內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定鱟試劑靈敏度使用廠家的內(nèi)毒素復(fù)核鱟試劑靈敏度廠家內(nèi)毒素交叉復(fù)核鱟試劑靈敏度使用廠家的內(nèi)毒素做干擾實(shí)驗(yàn)廠家的內(nèi)毒素做于定量實(shí)驗(yàn)2/1/202316博康3細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用的滅菌注射用水。滅菌注射用水內(nèi)毒素含量PH值無干擾作用2/1/202317博康4環(huán)境為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，防止污染，內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)應(yīng)在密閉的潔凈室中或密閉實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺下進(jìn)行?！?010年版藥品GMP實(shí)施指南密閉的潔凈室中密閉實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺實(shí)驗(yàn)室溫度：≤26℃實(shí)驗(yàn)室濕度：45%～75%2/1/202318博康1）溫度將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2λ，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保溫。實(shí)驗(yàn)中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達(dá)49℃保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。從實(shí)驗(yàn)可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在25～41℃之間，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度也升高，41℃尚未達(dá)到反應(yīng)速度峰值，25℃時反應(yīng)速度已相當(dāng)快；在41～46℃之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達(dá)到49℃或更高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應(yīng)速度反而降低。2/1/202319博康2）濕度吸潮靈敏度增高揮發(fā)2/1/202320博康5實(shí)驗(yàn)器皿器皿的計量管理（校正）器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn)器皿的正確處理2/1/202321博康1）器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn)鱟試驗(yàn)對器皿的要求：刻度準(zhǔn)確；內(nèi)表面光滑；易于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過校正的玻璃刻度移液管或精密移液器。注射器刻度不精確，內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗(yàn)結(jié)果的干擾，故不宜選用注射器。2/1/202322博康

如果用量不大，使用頻率不高，建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內(nèi)毒素和β-葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括,無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。2/1/202323博康2）器皿的正確處理2010年版《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》310頁——細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“3實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備”規(guī)定：3.1.1玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。2/1/202324博康

3.1.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250℃，待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計時，干烤30分鐘以上。達(dá)到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。2/1/202325博康蒸餾水有效期應(yīng)該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗?！庇械目蛻羰褂梅礉B透制備的純化水沖洗試驗(yàn)用玻璃器皿，結(jié)果試驗(yàn)中所有的陽性對照都為陰性，復(fù)核鱟試劑靈敏度時試驗(yàn)結(jié)果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。2/1/202326博康6

實(shí)驗(yàn)人員

負(fù)責(zé)質(zhì)量檢驗(yàn)的人員應(yīng)受過適當(dāng)教育，并經(jīng)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，具有基礎(chǔ)理論知識和實(shí)際操作技能。質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室所有人員的職責(zé)應(yīng)當(dāng)書面規(guī)定。內(nèi)毒素檢測人員應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格的培訓(xùn)，并應(yīng)配備相應(yīng)的防護(hù)設(shè)施（如穿防護(hù)服、戴口罩、頭套等）。——2010年版藥品GMP實(shí)施指南2/1/202327博康7

樣品β-葡聚糖樣物質(zhì)的影響PH值的影響金屬離子和弱酸陰離子的影響藥物濃度的影響

2/1/202328博康1）β-葡聚糖樣物質(zhì)的影響常見現(xiàn)象：假陽性。鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。2/1/202329博康目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和β-葡聚糖，而內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，β-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點(diǎn)的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，是將其它物質(zhì)（如β-葡聚糖）判定為內(nèi)毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經(jīng)濟(jì)損失。2/1/202330博康鱟試劑反應(yīng)機(jī)理圖2/1/202331博康判斷假陽性的方法：1、特異性鱟試劑法；2、定量反應(yīng)曲線分析法；3、家兔模擬試驗(yàn)法。2/1/202332博康2）PH值對反應(yīng)速度的影響常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜pH在6.5-8.0；pH≤3或≥10時，酶活性受到抑制。相對活力PH7.02/1/202333博康PH對反應(yīng)速度的影響:影響酶原的激活；影響酶分子的構(gòu)象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構(gòu)象，或甚至改變整個酶分子的機(jī)構(gòu)使其變性失活。2/1/202334博康故鱟試驗(yàn)時，供試品pH最好應(yīng)預(yù)調(diào)和6.5-8.0為好，必要時可用無內(nèi)毒素的HCl

或NaOH

稀溶液調(diào)節(jié)pH值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8.0。2/1/202335博康3）金屬離子和弱酸陰離子

離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強(qiáng)度較大會引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應(yīng)具有強(qiáng)抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。許多藥物因PH值≥10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的Ca2+、Mg2+離子，使實(shí)驗(yàn)呈假陰性。2/1/202336博康4）藥物濃度1、10%葡萄糖注射液2、白蛋白、小牛血清3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉4、中藥類注射液

2/1/202337博康7試驗(yàn)操作規(guī)程操作時間操作順序操作細(xì)節(jié)2/1/202338博康

1）操作時間

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2λ，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，37℃保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著時間的延長而堅固。因此夏天室溫較高，如果試驗(yàn)操作時間太長，細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不等進(jìn)入反應(yīng)儀器反應(yīng)已開始，實(shí)際反應(yīng)時間超過1小時。由于室溫不同，冬夏季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會很大。即使在25℃準(zhǔn)室溫下操作，操作時間拖得過長，細(xì)菌內(nèi)毒素含量較高時，測定誤差也不會小。2/1/202339博康2）操作順序操作時嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，安瓿開啟前應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品