細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)大全

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心WenzhouMedicalCollegeCentralLaboratoryofBiologyCO2培養(yǎng)箱使用李

東CO2培養(yǎng)箱WenzhouMedicalCollege

全世界的用戶對(duì)二氧化碳培養(yǎng)箱都有兩條最基本的要求，一是要求二氧化碳培養(yǎng)箱能夠?qū)囟?、二氧化碳濃度和濕度提供最精確穩(wěn)定的控制，以便于其研究工作的進(jìn)展；二是要求二氧化碳培養(yǎng)箱能夠?qū)ε囵B(yǎng)箱內(nèi)的微生物污染進(jìn)行有效的防范。

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege一、二氧化碳進(jìn)氣壓力：0.08~0.1MPa(0.8-1bar)

壓力表選用：初級(jí)壓力25MPa，次級(jí)壓力0.2MPa。松→緊壓力低→高。進(jìn)氣正常的現(xiàn)象。壓力過(guò)高的危害，注意安全。壓力調(diào)節(jié)穩(wěn)定需要時(shí)間，原因：殘余氣體，壓力表不穩(wěn)。。二、溫度控制培養(yǎng)箱的最低工作溫度一般是高于室溫5°C，空氣循環(huán)提高溫度均一性。溫度恢復(fù)時(shí)間（37℃），開門時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超溫；水盤的水溫影響。門加熱系統(tǒng)，即使箱內(nèi)相對(duì)濕度高達(dá)98%，所有內(nèi)壁表面亦能保持完全干燥。

▼CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege

▲幻燈片3CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege三、二氧化碳濃度控制按培養(yǎng)基中的NaHCO3設(shè)定二氧化碳濃度：NaHCO31.97g/L，CO2濃度5%；NaHCO33.95g/L，CO210%。RPMI1640培養(yǎng)基每升2.1g碳酸氫鈉；DMEM每升3.7克碳酸氫鈉；F12NaHCO31.18g/L;DMEM/F12NaHCO32.56g/L。

HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。注意CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege四、相對(duì)濕度水盤蒸發(fā)面積大，增強(qiáng)蒸發(fā)作用，使培養(yǎng)箱內(nèi)能快速達(dá)到飽和濕度狀態(tài)。無(wú)菌蒸餾水，定期檢查、定期更換。二氧化碳培養(yǎng)箱停止使用時(shí)，除水，否則發(fā)霉。

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege五、防污染和消毒滅菌空氣過(guò)濾：HEPA過(guò)濾器能過(guò)濾培養(yǎng)箱內(nèi)空氣，可過(guò)濾除去99.97%的0.3微米以上的顆粒，箱體關(guān)閉后5分鐘內(nèi)達(dá)到空氣100級(jí)。乙醇消毒。紫外消毒：紫外消毒能力是與紫外燈距離目標(biāo)的距離的二次方成反比，距離越遠(yuǎn)，消毒能力越差，且無(wú)穿透能力，難以達(dá)到徹底滅菌的要求；高溫濕熱：目前比較有效消毒滅菌的方法，高溫消毒又分為兩類，一是傳統(tǒng)的高溫干熱消毒，另一種是先進(jìn)的高溫濕熱滅菌。CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege六、重要提示需要定時(shí)更換的部件：HEPA過(guò)濾器、空氣過(guò)濾器

需要定時(shí)處理的工作：消毒、水盤

CO2培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege

▲幻燈片3細(xì)胞培養(yǎng)室WenzhouMedicalCollegeBiotechnologyResearchPlatform細(xì)胞培養(yǎng)室WenzhouMedicalCollege無(wú)菌級(jí)別：萬(wàn)級(jí)，局部100級(jí)Nikon

倒置生物顯微鏡NikonDS-5M-L1顯微攝影系統(tǒng)Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱Labsystems

BioMate電動(dòng)移液器細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege

細(xì)胞培養(yǎng)室的大小依需要而定，一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)和幾個(gè)操作間相通。操作間放在內(nèi)間，主要供無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房間應(yīng)不受日光直射，大小適當(dāng)，高度適宜(2.5m)。房間過(guò)大，清掃和消毒不便；過(guò)小，操作不便；頂部過(guò)高會(huì)影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應(yīng)光滑無(wú)死角，以便清洗和消毒。

細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege細(xì)胞培養(yǎng)室的日常維護(hù)和操作規(guī)程：㈠、日常維護(hù)1、定期打掃無(wú)菌室：每周打掃一次，先用自來(lái)水擦地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3‰

來(lái)蘇爾或者新潔爾滅擦拭。2、無(wú)菌室實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)30分鐘。3、無(wú)菌室實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75％酒精擦拭超凈臺(tái)（有機(jī)玻璃面板不能用酒精擦拭）、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)，打開紫外燈照射30分鐘。細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege㈡、進(jìn)入無(wú)菌室的實(shí)驗(yàn)人員無(wú)菌準(zhǔn)備：

1、肥皂洗手，75％酒精泡手。

2、帶好手套、穿好隔離衣、拖鞋、帶好隔離帽、口罩。

3、用75％酒精棉球擦凈雙手（酒精不可過(guò)多，防止著火）。細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項(xiàng)WenzhouMedical

College㈢、無(wú)菌室內(nèi)的操作要求和注意事項(xiàng)：1、凡是帶入無(wú)菌室的試劑（酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等）的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。2、動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸、手。3、吸取兩種以上的試劑時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。4、不同細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）內(nèi)使用的吸管要注意更換，防止污染擴(kuò)大。細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege誤區(qū)：紫外燈消毒滅菌時(shí)間。消毒的效能與距離成反比，進(jìn)行空氣消毒時(shí)燈管應(yīng)距地面2．5m以內(nèi)；臺(tái)面的消毒應(yīng)在80cm以內(nèi)；培養(yǎng)器皿的消毒在30cm以內(nèi)。消毒的時(shí)間與效能存在一定關(guān)系，但不是絕對(duì)的：照射20min后，有71％的細(xì)菌被消滅；40min后79％的細(xì)菌被消滅；60min后86％的細(xì)菌被消滅。紫外線照射時(shí)間再長(zhǎng)也不是100％的滅菌，最多只能把90％的細(xì)菌消滅，過(guò)長(zhǎng)的照射是沒(méi)有意義的。如用于紫外線照射帶菌的器皿，應(yīng)與其他消毒方法結(jié)合使用，如先用75％的酒精浸泡，再照紫外線消毒滅菌等。細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項(xiàng)WenzhouMedicalCollege誤區(qū)：鼓風(fēng)機(jī)風(fēng)速要適當(dāng)。超凈工作臺(tái)注意過(guò)濾器的效果，一般2-3年更換一次，以保持過(guò)濾器的凈化效果。

廢液缸處理。

及時(shí)關(guān)閉空氣循環(huán)器

及時(shí)關(guān)閉空調(diào)光學(xué)顯微鏡的使用

李東生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心—、普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機(jī)械部分、照明部分和光學(xué)部分—、普通光學(xué)顯微鏡

顯微鏡清晰度決定于放大倍數(shù)和顯微鏡的分辨力，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長(zhǎng)和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：R=0.61λ/N.A，N.A＝ｎsinα/2介質(zhì)的折射率:空氣(1)水(1.33)香柏油(1.515)

光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對(duì)于干燥物鏡來(lái)說(shuō)，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)通常為1000X。二、熒光顯微鏡

二、熒光顯微鏡熒光顯微鏡濾色片參數(shù)

MWU:波長(zhǎng)330~385nm高通濾色片：420nm

MWB(藍(lán)光激發(fā)):波長(zhǎng)450~480nm高通濾色片：515nm

觀察綠色熒光的樣品，例：FITC（激發(fā)490nm，熒光波長(zhǎng)520nm）

EB：激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng)620nm

（RNA，DNA：紅色；可進(jìn)入死細(xì)胞）

AOPI：激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm

（DNA：綠色；RNA：紅色；可進(jìn)入活細(xì)胞）WIG(綠光激發(fā)):波長(zhǎng)510~550nm高通濾色片：590nm

觀察紅色熒光的樣品二、熒光顯微鏡熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別：照明方式通常為落射式，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上；2.光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。三、倒置相差顯微鏡

可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。相差顯微鏡的基本原理是，把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長(zhǎng)），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小，提高反差。三、倒置相差顯微鏡三、倒置相差顯微鏡相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的不同點(diǎn)：1、環(huán)形光闌位于光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2、相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

1、A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

2.、B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。用ＭＴＴ比色法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)WenzhouMedicalCollege

取有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板的，每孔內(nèi)加入5mg/mlＭＴＴ20μl，4ｈ后每孔加入50%二甲亞砜水溶液150μL，振蕩10Min，570nm(或490nm)處測(cè)定OD值，作為細(xì)胞相對(duì)數(shù)。注意：MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

制備細(xì)胞爬片WenzhouMedicalCollege1、在無(wú)菌培養(yǎng)皿或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪上滅菌后的蓋玻片，在每片蓋玻片上滴一滴計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為2×104/ml）。再在每片蓋玻片上滴加培養(yǎng)液至剛好覆蓋滿蓋玻片。將培養(yǎng)皿（6孔細(xì)胞培養(yǎng)板）置于37℃，含5%CO2及飽和濕度的

CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、4小時(shí)后將培養(yǎng)液加量至覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿的底面。

制備細(xì)胞爬片WenzhouMedicalCollege3、倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞增殖到合適的密度后取出培養(yǎng)皿中止培養(yǎng)（一般為3-5

天）。

4、傾去培養(yǎng)液，加PBS（PH7.2～7.4）洗滌細(xì)胞爬片2次，每次1min。5、加10%中性甲醛（或-20℃預(yù)冷的丙酮）固定10～15min。6、吸除固定液，加PBS再洗滌細(xì)胞爬片2

次，每次1min。

制備細(xì)胞爬片WenzhouMedicalCollege

7、置于室溫下干燥1小時(shí)，如暫不染色，先放在-20冰箱中保存。8、取出蓋玻片時(shí)注意蓋玻片的正反面（有細(xì)胞的為正面）。

細(xì)胞爬片的免疫化學(xué)染色法WenzhouMedicalCollege

1、在細(xì)胞爬片上加0.03%TritonX-100水溶液處理15min。（若是要檢測(cè)的抗原表達(dá)于胞漿，此步可考慮省略）

2、吸除0.03%TritonX-100，加3%H2O2孵育10min。

3、吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封閉30～60min。PBS洗5min。

細(xì)胞爬片的免疫化學(xué)染色法WenzhouMedicalCollege

4、吸除PBS，分別滴加相應(yīng)的一抗（用