版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
菠菜actin基因片段的克隆植物基因組DNA提取DNA的PCR擴增及其產(chǎn)物回收DNA與載體的連接和轉(zhuǎn)化是基因工程中最基本的操作技術(shù)主要包括以下實驗技術(shù):基因工程狹義:人工創(chuàng)造DNA分子新組合的技術(shù)(即重組DNA技術(shù))廣義:重組DNA技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化設(shè)計和應(yīng)用,包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大部分。上游技術(shù)是指重組DNA技術(shù);下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或基因工程細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因表達產(chǎn)物的分離和純化,動、植物轉(zhuǎn)基因等DNA重組微生物發(fā)酵分離、提純產(chǎn)品生物反應(yīng)器狹義轉(zhuǎn)基因廣義+提取DNA篩選文庫/PCR連接載體細胞DNA載體重組載體宿主擴增(基因)酶切基因基因轉(zhuǎn)化+上游技術(shù)下游為基因測序和其它研究和應(yīng)用準(zhǔn)備高質(zhì)量的基因片段。YourTextYourTextYourTextPCR及檢測連接轉(zhuǎn)化篩選實驗流程及原理YourText回收鑒定YourText測序DNA提取及檢測產(chǎn)物回收等引物…………….....……………………..……5’-3’--3’-5’
引物設(shè)計正向引物(Forward)→←反向引物(Reverse)正向引物:TCATTCTCTGATCCGTGCAG1.對引物的一般要求
(1)長度一般為18-27nt(2)GC含量為40-60%(3)引物在模板內(nèi)沒有其它高度相似的序列
(4)引物間和引物內(nèi)不形成二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)
(5)引物之間的Tm值應(yīng)基本相同(
Tm估計值與計算方法有關(guān))
(6)3’端避免出現(xiàn)3個及以上連續(xù)的相同堿基反向引物:AGGCAAGCTTTTCCTTCACA3.引物設(shè)計工具(1)引物設(shè)計軟件
Oligo6.44
PrimerPremier
5.0
Dnastar(2)網(wǎng)上引物設(shè)計工具
Primer3
/primer3/input.htm2.
DNA序列的來源
(1)查詢序列數(shù)據(jù)庫(2)查閱科技文獻(3)測序TheNationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.)例1:查詢Spinaciaoleraceaactingene序列2023/2/1/primer3/input.htm例2:利用Primer3設(shè)計引物①復(fù)制和粘貼DNA序列①②②③②勾選所需的引物③獲取引物
連接Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A;
T載體是一種帶有3’T突出端的載體;在連接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(MCS)中。
高效克隆PCR產(chǎn)物(TACloning)的專用載體
轉(zhuǎn)化細胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法,化學(xué)試劑法(CaCl2)等的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。3、鑒定--
α-互補質(zhì)粒載體帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時存在時,能恢復(fù)lacZ酶的活性,稱為α-互補。在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落,因而易于識別。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。Yo
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 蘇教版2018年四年級下學(xué)期數(shù)學(xué)全冊教案教學(xué)設(shè)計
- 《憶讀書》書海教案
- 《我的戰(zhàn)友邱少云》紀(jì)律與犧牲精神教案
- 快遞公司合作協(xié)議書范本(標(biāo)準(zhǔn)版)
- 房東中介合作協(xié)議書模板
- 冰雪項目施工協(xié)議書模板
- 包裝項目合作協(xié)議書模板
- 2024買賣合同合同糾紛案民事答辯狀
- 2024裝修合同樣本
- 2024關(guān)于物業(yè)管理委托合同范本
- 選礦廠管理制度大全
- 建設(shè)數(shù)字地理創(chuàng)新實驗室
- 青山中學(xué)科技創(chuàng)新活動實施方案(試行)
- U500尿液分析儀測試原理及故障分析
- 安徽省雨露計劃職業(yè)教育補助申請學(xué)籍證明模板
- 歷年黃金價格表1975-2003年
- 營運船舶檢驗技術(shù)資料
- MPIF標(biāo)準(zhǔn)35金屬注射成形零件材料標(biāo)準(zhǔn)
- 農(nóng)產(chǎn)品收購臺賬(登記經(jīng)營單位及個體經(jīng)營者投售的農(nóng)產(chǎn)品
- 管理創(chuàng)新與思維創(chuàng)新.ppt
- 計算機網(wǎng)考試題
評論
0/150
提交評論