酶工程2-2常用的產(chǎn)酶微生物

第二節(jié)常用的產(chǎn)酶微生物一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育

1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件（1）酶產(chǎn)量高（2）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低）（3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化（4）易分離提純（5）安全可靠（不是致病菌）2.常用的產(chǎn)酶微生物細(xì)菌：大腸桿菌、枯草桿菌放線菌：鏈霉菌霉菌：黑曲霉、米曲霉、紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉酵母：啤酒酵母、假絲酵母

3.產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品

2)富集培養(yǎng):投其所好，取其所抗

3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pureculture）。

4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。

5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)為主。

4.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育誘變育種原生質(zhì)體融合育種基因工程育種細(xì)菌1.大腸桿菌(Escherichiacoli)

形態(tài)：呈桿狀,有的近似球狀,大小為0.5μm×1～3μm,一般無莢膜,無芽孢,運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)者周生鞭毛。菌落從白色到黃白色,光滑閃光,擴(kuò)展。革蘭氏染色陰性。產(chǎn)生的酶一般都屬于胞內(nèi)酶,需要經(jīng)過細(xì)胞破碎才能分離得到。采用大腸桿菌生產(chǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、核酸外切酶等,在基因工程等方面廣泛應(yīng)用。2.枯草桿菌(Bacillussubtilis)

形態(tài)：芽孢桿菌屬細(xì)菌，細(xì)胞呈桿狀,大小為0.7～0.8μm×2～3μm,單個(gè)細(xì)胞,無莢膜,周生鞭毛,運(yùn)動(dòng)。芽孢0.6～0.9μm×1～1.5μm,橢圓至柱狀菌落粗糙,不透明,不閃光,擴(kuò)張,污白色或微帶黃色。革蘭氏染色陽性。枯草桿菌是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物,可以用于生產(chǎn)α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和堿性磷酸酶等。例如,枯草桿菌BF7658是國內(nèi)用于生產(chǎn)α-淀粉酶的主要菌株;枯草桿菌AS1.398用于生產(chǎn)中性蛋白酶和堿性磷酸酶。枯草桿菌生產(chǎn)的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶,而其產(chǎn)生的堿性磷酸酶存在于細(xì)胞間質(zhì)之中。放線菌具有分支狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物。常用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的放線菌主要是鏈霉菌(Streptomyces)。鏈霉菌(Streptomyces)鏈霉菌菌落呈放射狀,具有分支的菌絲體,菌絲直徑0.2～1.2μm,革蘭氏染色陽性。菌絲有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲之分,基內(nèi)菌絲不斷裂,只有氣生菌絲形成孢子鏈。鏈霉菌是生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的主要微生物,同時(shí)還可以用于生產(chǎn)青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。鏈霉菌還含有豐富的16α羥化酶,可用于甾體轉(zhuǎn)化。霉菌1.黑曲霉(Aspergillus

niger)

是曲霉屬黑曲霉群霉菌。菌絲體由具有橫隔的分支菌絲構(gòu)成,菌叢黑褐色,頂囊大球形,小梗雙層,分生孢子球形,平滑或粗糙。黑曲酶可用于生產(chǎn)多種酶,有胞外酶也有胞內(nèi)酶。例如,糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纖維素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。2.米曲酶(Aspergillus

oryzae)

是曲霉屬黃曲霉群霉菌。菌叢一般為黃綠色,后變?yōu)辄S褐色,分生孢子頭呈放射形,頂囊球形或瓶形,小梗一般為單層,分生孢子球形,平滑,少數(shù)有刺,分生孢子梗長達(dá)2mm左右,粗糙。米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力較強(qiáng),這使米曲霉在我國傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲的制造中廣泛應(yīng)用。此外,米曲霉還可以用于生產(chǎn)氨基?；?、磷酸二酯酶、果膠酶、核酸酶P等。3.紅曲霉(Monascus)

紅曲霉:菌落初期白色,老熟后變?yōu)榈凵?、紫紅色或灰黑色,通常形成紅色色素。菌絲具有隔膜,多核,分支甚繁。分生孢子著生在菌絲及其分支的頂端,單生或成鏈,閉囊殼球形,有柄,其內(nèi)散生10多個(gè)子囊,子囊球形,內(nèi)含8個(gè)子囊孢子,成熟后子囊壁解體,孢子則留在閉囊殼內(nèi)。紅曲霉可用于生產(chǎn)α淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶等。4.青霉青霉(Penicillium):屬半知菌綱。其營養(yǎng)菌絲體無色、淡色或具有鮮明的顏色,有橫隔,分生孢子梗亦有橫隔,光滑或粗糙,頂端形成帚狀分支,小梗頂端串生分生孢子,分生孢子球形、橢圓形或短柱形,光滑或粗糙,大部分生長時(shí)呈藍(lán)綠色。有少數(shù)種會(huì)產(chǎn)生閉囊殼,其內(nèi)形成子囊和子囊孢子,亦有少數(shù)菌種產(chǎn)生菌核。青霉菌種類很多,其中產(chǎn)黃青霉(Penicillium

chrysogenum)用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素?；?主要作用于青霉素)果膠酶、纖維素酶等。橘青霉(Penicillium

cityrinum)用于生產(chǎn)5′磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。5.木霉木霉(Trichoderma)屬于半知菌綱。生長時(shí)菌落生長迅速,呈棉絮狀或致密叢束狀,菌落表面呈不同程度的綠色,菌絲透明,有分隔,分支繁復(fù),分支上可繼續(xù)分支,形成二級(jí)分支、三級(jí)分支,分支末端為小梗,瓶狀,束生、對(duì)生、互生或單生,分生孢子由小梗相繼生出,靠黏液把它們聚成球形或近球形的孢子頭。分生孢子近球形、橢圓形、圓筒形或倒卵形。光滑或粗糙,透明或亮黃綠色。木霉是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。木霉生產(chǎn)的纖維素酶中包含有C1酶、Cx酶和纖維二糖酶等。木霉中含有較強(qiáng)的17-α羥化酶,常用于甾體轉(zhuǎn)化。6.根霉根霉(Rhizopus)生長時(shí),由營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生匍匐枝,匍匐枝的末端生出假根,在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗,梗的頂端膨大形成孢子囊,囊內(nèi)產(chǎn)生孢子囊孢子。孢子呈球形、卵形或不規(guī)則形。根霉可用于生產(chǎn)糖化酶、α-淀粉酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。根霉有強(qiáng)的11-α羥化酶,是用于甾體轉(zhuǎn)化的重要菌株。7.毛霉毛霉(Mucor)的菌絲體在基質(zhì)上或基質(zhì)內(nèi)廣泛蔓延,無假根。菌絲體上直接生出孢子囊梗,一般單生,分支較少或不分支。孢子囊梗頂端都有膨大成球形的孢子囊,囊壁上常有針狀的草酸鈣結(jié)晶。毛霉常用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、α淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。酵母1.啤酒酵母啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

是啤酒工業(yè)上廣泛應(yīng)用的酵母。細(xì)胞圓形、卵形、橢圓形或臘腸形。在麥芽汁培養(yǎng)基上,菌落為白色,有光澤,平滑,邊緣整齊。營養(yǎng)細(xì)胞可以直接變?yōu)樽幽?每個(gè)子囊含有1～4個(gè)圓形光亮的子囊孢子。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒類的生產(chǎn)外,還可以用于轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等的生產(chǎn)。2.假絲酵母假絲酵母(