RGQ安裝時應用培訓

TheRotor-GeneQ應用培訓5種型號，滿足不同的需要Rotor-GeneQ2Plex Rotor-GeneQ2PlexHRM Rotor-GeneQ5Plex Rotor-GeneQ5PlexHRM Rotor-GeneQ6Plex

產(chǎn)品概況工作過程旋轉(zhuǎn)模式

儀器運行時轉(zhuǎn)盤速度

400RPM(加熱和冷卻)

高速數(shù)據(jù)收集

樣品旋轉(zhuǎn)一次，數(shù)據(jù)收集一次

(0.15sec)

重力作用讓試劑都在管底

除去氣泡和濃縮

組分不會形成沉淀持續(xù)運動保證無差異

孔與孔間的溫度和光學400

RPM>10

G離心式鼓風機混勻腔體內(nèi)的空氣腔體門關上，密封腔體內(nèi)的空氣轉(zhuǎn)盤上的孔能讓空氣自由通過升溫加熱開空氣進離心式鼓風機把空氣吸入腔體內(nèi)腔體門打開，排出熱空氣加熱關轉(zhuǎn)盤上的孔能讓空氣自由通過降溫

離心式鼓風機混勻腔體內(nèi)的空氣光學通路光學通路激發(fā)光發(fā)射光PCR轉(zhuǎn)子和PCR管類型136孔轉(zhuǎn)子-適用

0.2ml平蓋PCR管推薦反應體積20–50μL72孔轉(zhuǎn)子

-適用0.1mlPCR連管推薦反應體積10–50μL

#981005；#981008#981103；#981106轉(zhuǎn)盤72

-72個樣品Rotor-Disc72，管容積50μL推薦反應體積20–25μL

需要密封膜和加熱器轉(zhuǎn)盤100

-100個樣品Rotor-Disc100，管容積30

μL推薦反應體積15–25μL需要密封膜和加熱器加熱器，#9019725Rotor-Disc72，#

981301Rotor-Disc100，#

981311密封膜，#981601PCR轉(zhuǎn)子和PCR管類型2加熱器用來密封

Rotor-Disc密封后不能取下工作流程預熱取下膜中間的封紙把膜放在

Rotor-Disc正上方放進入加熱器中，拉下壓桿等警報音響，從加熱器中取出注意–至少放置10秒冷卻把膜多余的部分撕走小心地從加熱板上取下Rotor-Disck開始……點擊此圖標運行設置運行設置

-QuickStart模式選擇模板運行設置

-QuickStart模式選擇轉(zhuǎn)子運行設置

-QuickStart模式確定步驟之——Hold運行設置

-QuickStart模式確定步驟之——Cycling運行設置

-QuickStart模式確定步驟之——Cycling關于Acquiring運行設置

-QuickStart模式確定步驟之——Cycling關于Acquiring運行設置

-QuickStart模式確定步驟之——Melt選做運行設置

-

Advanced

模式選擇模板運行設置

-

Advanced

模式選擇轉(zhuǎn)子運行設置

-

Advanced

模式輸入信息運行設置

-

Advanced

模式步驟和檢測設置運行設置

-

Advanced

模式步驟和檢測設置之確定步驟與QuickStart模式的確定步驟同運行設置

-

Advanced

模式步驟和檢測設置之GainOptimisation運行設置

-

Advanced

模式步驟和檢測設置之GainOptimisation運行設置

-

Advanced

模式Channel–

設置需要的數(shù)據(jù)收集通道，如果設置了多個通道，確定后有后續(xù)的相應通道的對話框彈出。TubePosition–

保證所選的位置是能夠反應并發(fā)熒光的(一般是標準品)。TargetSampleRange–

與所用的檢測化合物有關：

嵌入式染料(Intercalatingdyes

)應設置為1-3Fl單位；

探針染料(Probes)一般應設置為

5-10Fl單位； QuenchedFRET

檢測應設置為70-80Fl

單位，因為隨著反應進行其熒光值將降低

。AcceptableGainRange–

應為默認的

-10to+10步驟和檢測設置之GainOptimisation運行設置

-

Advanced

模式步驟和檢測設置之GainOptimisation運行設置

-

Advanced

模式設置完成關于Longrange:在到達設置的循環(huán)數(shù)后，每一循環(huán)該步驟（一般設置變性階段）都增加1秒。關于Touchdown:在到達設置的循環(huán)數(shù)后，每一循環(huán)的該步驟（一般設置退火階段）都降低1℃。Melt:從一個較低溫度升到一個較高溫度，溶劑的特性，與核酸的特有屬性。HRM:HighResolutionMelt，高分辨率的熔解曲線，只有在裝了HRM硬件的儀器上才能運用。運行設置

-

額外設置1關于OpticalDenaturationCycling:用熒光強度來判斷變性是否完成運行設置

-

額外設置2運行設置補充說明-

DataAcquisition設置運行程序時要設置數(shù)據(jù)采集點數(shù)據(jù)采集點可以在任何的一個步驟的終結時，并以藍色的點作標記。可以通過點擊“Acquiring”作數(shù)據(jù)收集的設置。從列表中選擇需要的數(shù)據(jù)收集通道，可以選擇多通道。點擊“DyeChart”可觀測數(shù)據(jù)收集通道的信息，包括激發(fā)光和發(fā)射光波長，可以應用的染料或顯色劑。在程序的任何或所有步驟都能設數(shù)據(jù)收集點。當數(shù)據(jù)曲線飽和，會在縱坐標100處形成橫線。設置和調(diào)整Gain值1設置Gain值，讓所有收集到的數(shù)據(jù)都在檢測器(PMT)能檢測的范圍內(nèi)

如果Gain值：

過低

→信號會因埋沒在在本底噪聲內(nèi)而漏掉；

過高→信號會超出范圍(飽和).

如果熔解曲線中，開始的一段時間縱坐標100處形成橫線，熔解曲線應用較低的Gain設置來收集數(shù)據(jù)，但無需再重復做擴增反應。實際數(shù)據(jù)的不會因Gain值設置而改變，Gain值設置改變了也能反映實際的數(shù)據(jù)變化趨勢。每個數(shù)據(jù)采集通道的Gain值范圍是

-10~10：-10為最低的敏感度；+10最高敏感度。

0481026-2-4-6-8-1024816326412825651210242048Gain值設置每增加1，對PMT的輸入電壓約能增加2倍，這樣對熒光檢測的敏感度能增加2倍。Gain值的設置不可能每次都適用，最好能在hold階段根據(jù)實驗的奔底而做出改變。使用Auto-Gain設置能自動檢測反應初始時的熒光強度，設定出合適的Gain值。當使用Auto-Gain設置時，在運行初始會出現(xiàn)該界面。設置和調(diào)整Gain值2編輯樣品1.命名樣品2.選擇樣品的“Type”：UnknownNoneNTCStandardPositivecontrolNegativecontrolCalibrator4.Groups–用作統(tǒng)計分析5.GivenConc.只有type是”Standard”時可編輯，用于制作標準曲線。3.是否選擇–

Selected6.Color用于顏色區(qū)分圖表中不同的樣品。綜述:AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassaysSABustinJ.Mol.Endo200025,169-193標準曲線通過已知濃度的cDNA/RNA建立關鍵因素: -DNA/RNA片段要純，單一片段 -移液準確 -標準樣品稀釋準確，平行性好

絕對定量絕對定量標準曲線由5個或以上已知濃度樣品而確定。一般每個濃度的樣品做3個重復。如果每個梯度相差10倍，最理想的狀態(tài)是，PCR的效率足夠高到達2，預期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根。未知濃度的目標樣品，其濃度和熒光值的變化規(guī)律與標準曲線一致。5,00050,000500,0005,000,00050,000,000500,000,000CTamount1.曲線上的Ct與濃度的log關系2.標準曲線

3.根據(jù)標準曲線計算反應效率反應效率與斜率(m)相關E=10(-1/m)–1E=1=100%.4.判定系數(shù)(R2)表示假設值與真實值的相關性，

越接近1相關性越好。絕對定量與反應效率

絕對定量絕對定量AbsoluteQuantitation絕對定量絕對定量的準確性完全決定于標準樣品的準確性絕對定量參考文獻:AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassaysSABustinJ.Mol.Endo200025,169-193標準曲線由已知濃度的cDNA/RNA構建關鍵因素: -DNA/RNA一定是純的，只有一種片段的 -移液準確 -稀釋準確平行性好

-未知濃度的樣品的點能落在標準曲線上絕對定量相對定量Analysis>Quantitation>CyclingAGreen>Show>OK>Threshold>手動調(diào)閾值，得出Ct值熔解的特性是不同核酸的固有特性一般是用嵌入式染料分析PCR產(chǎn)物，加熱熔解——從雙鏈到單鏈不同的片段（如堿基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感，能夠區(qū)分一個堿基改變而引起的差別

(e.g.SNPs)HRM比較熔解曲線的型狀和溫度來區(qū)分不同樣品的特性HRM原理雙鏈產(chǎn)物單鏈產(chǎn)物HRM試劑嵌入式染料的熒光隨著雙鏈的解開而降低，其熒光強度與解鏈的特性相關高精度的溫度控制和光學數(shù)據(jù)收集，能得到十分詳細和分辨率高的數(shù)據(jù)。HRM工作流程擴增設置正常的PCR步驟和HRM步驟，用嵌入式染料

(e.gSYTO9)每個基因型都應設置Control(eg.已確定的wild-type,heterozygote,variant樣品)

檢測擴增曲線和擴增效率 (擴增不好，HRM的結果也不好)HRM分析運行HRM分析指定controls觀測結果HRM運行設置HRM分析HRM分析儀器的維護保養(yǎng)1.光學檢測鏡頭定期清潔，棉簽蘸酒精擦拭光學檢測鏡頭。2.保持實驗臺清潔防止雜物進入，保證降溫效果，應保持儀器附近區(qū)域的清潔，特別是儀器底部紙屑、毛發(fā)等雜物。3.常保持儀器蓋關閉4.腔體污染后的清潔先用物屑紙巾蘸0.1%的次氯酸鈉溶液擦拭腔體，然后用PCR級的水清潔干凈。問題解決OnlineHelp文件：Help>Contents(或在NewRun對話框