第2章酶反應(yīng)的基本原理

第二章酶反應(yīng)的基本原理提要：一、酶的組成及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二、酶的催化作用機(jī)理三、酶的類型及命名四、影響酶催化反應(yīng)的因素

1.酶的概念酶：生活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊空間構(gòu)像的,能進(jìn)行生物催化作用的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸兩類物質(zhì)，其中以蛋白質(zhì)為主。一、酶基本知識（1）酶與一般催化劑的共性

用量少，催化效率高不改變反應(yīng)平衡點(diǎn)可降低反應(yīng)活化能（2）酶的特性

高效性：以酶的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat表示，mol底物/mol酶.min

酶的Kcat為103-107mol底物/mol酶.min，比非酶催化效率高107-1013

倍。

專一性：結(jié)構(gòu)專一性（相對專一性/絕對專一性）立體異構(gòu)專一性(幾何異構(gòu)/旋光異構(gòu))

溫和性（不穩(wěn)定性）：酶催化需要的活化能低，生物大分子，結(jié)構(gòu)穩(wěn)固性差。

可調(diào)控性：底物濃度、溫度、pH、抑制劑和激活劑等。

2、酶的聚集方式（1）松散排列酶在細(xì)胞中各自以可溶的單體形式存在，彼此沒有結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。反應(yīng)時(shí)酶是隨機(jī)擴(kuò)散，催化效率不高。（如糖酵解歷程）酶1酶2酶3酶4酶5（2）簇式排列幾種酶有機(jī)地聚集在一起，鑲嵌成一定的結(jié)構(gòu)，形成多酶復(fù)合體。催化效率高。（如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、脂肪酸合成酶、纖維素酶復(fù)合體）（3）與生物膜結(jié)合一種結(jié)構(gòu)更高的多酶復(fù)合體，酶整齊的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸鏈）酶1酶2酶4酶5酶3

單成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（簡單蛋白質(zhì)）雙成份酶（結(jié)合蛋白質(zhì)）酶蛋白輔因子（apoenzyme）（cofacter)輔酶（coenzyme)輔基(prostheticgroup)酶3、酶的組成

一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)4、酶的結(jié)構(gòu)層次維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵

a鹽鍵（離子鍵）b氫鍵c疏水相互作用力d范德華力e二硫鍵f酯鍵維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大疏水相互作用力對維持三級結(jié)構(gòu)特別重要鹽鍵數(shù)量小二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力鍵作用力性能5、酶的活性基團(tuán)及活性中心活性中心：結(jié)合部位和催化部位結(jié)合部位:決定酶的專一性催化部位:決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。酶活性中心示意圖部分酶活性中心的氨基酸殘基

酶殘基總數(shù)活性中心殘基牛胰核糖核酸酶124His12,His119,Lys41溶菌酶129Asp52,Glu35牛胰凝乳蛋白酶245His57,Asp102,Ser195牛胰蛋白酶238His46,Asp90,Ser183木瓜蛋白酶212Cys25,His159

彈性蛋白酶240His45,Asp93,Ser188枯草桿菌蛋白酶275His46,Ser221碳酸酐酶258His93-Zn-His95His117

二、酶的催化作用機(jī)理1、中間產(chǎn)物學(xué)說E+SESE+P

中間產(chǎn)物存在的證據(jù)：同位素32P標(biāo)記底物法（磷酸化酶與葡萄糖結(jié)合）；吸收光譜法（過氧化物酶與過氧化氫結(jié)合）。SEacabcESE-S復(fù)合物b2、誘導(dǎo)契合假說（induced-fithypothesis）酶與底物相互接近時(shí)，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。酶AB

3、趨近效應(yīng)與定向作用（proximityeffect&orientationarrange）底物和酶的活性中心結(jié)合在一有限區(qū)域內(nèi)互相接近，趨近效應(yīng)使底物在活性中心的局部濃度提高數(shù)干至數(shù)萬倍，大大增加底物互相碰撞的機(jī)會。

定向即底物和酶的活性中心結(jié)合時(shí)，可誘導(dǎo)酶蛋白的構(gòu)象變化，使底物和酶的活性中心更好地互補(bǔ)，并使底物有正確的定向。這樣，底物的反應(yīng)基團(tuán)更趨近酶的催化基團(tuán)。這又進(jìn)一步使反應(yīng)速度提高幾個數(shù)量級。

4、底物分子的形變與扭曲張力學(xué)說（strain）（1）酶受底物誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象改變，特別是活性中心的功能基團(tuán)發(fā)生的位移或改向，呈現(xiàn)一種高活性功能狀態(tài)。

（2）酶活性中心的某些基團(tuán)或金屬離子可改變底物敏感健的電子云分布，產(chǎn)生“電子張力”而易于斷裂，也可使底物的構(gòu)象改變，接近過渡態(tài)而易于反應(yīng)，這就是張力（）學(xué)說。

羧肽酶A和溶菌酶的X線衍射分析證明了張力效應(yīng)是酶催化的機(jī)制之一。5、多元催化(multielementcatalysis)多元催化：多個基元催化形式的協(xié)同作用。一般包括酸-堿催化，共價(jià)催化（親核催化,親電子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195親核催化，His-57堿催化等；酸-堿催化：通過暫時(shí)提供（或接受）一個質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)達(dá)到催化反應(yīng)的目的；

廣義酸基團(tuán)廣義堿基團(tuán)pKa

（質(zhì)子供體）（質(zhì)子受體）酶活性中心廣義酸堿基團(tuán)溶菌酶酸、堿催化反應(yīng)示意圖共價(jià)催化（親核催化,親電子催化）：通過催化劑與底物的共價(jià)鍵結(jié)合，形成過渡態(tài)來加速反應(yīng)。共價(jià)催化具有親核、親電過程。親核催化：分別帶有多電子的原子如O、S和N，可以提供電子去攻擊底物上相對帶正電子的原子（如羰基碳），即所謂的親核攻擊。親電催化：是由親電試劑(具有接受電子對的原子)引起的催化反應(yīng),是親核催化的反過程．

酶促反應(yīng)曲線產(chǎn)物0時(shí)間初速度酶促反應(yīng)速度逐漸降低三、酶促反應(yīng)動力學(xué)影響酶促反應(yīng)速度的因素底物濃度[S]酶濃度[E]反應(yīng)溫度pH值抑制劑激活劑1、底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響

vVm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]與v關(guān)系：當(dāng)[S]很低時(shí)，[S]與v成比例--一級反應(yīng)當(dāng)[S]較高時(shí)，[S]與v不成比例當(dāng)[S]很高時(shí)，[S]，v不變--零級反應(yīng)底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響（1）米氏方程（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米氏方程解釋：當(dāng)[S]Km時(shí)，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]當(dāng)[S]Km時(shí)，vVmax,即[S]而v不變米氏方程成立條件：

初速度為標(biāo)準(zhǔn)單底物穩(wěn)態(tài)（steadystate）（2）米氏方程推導(dǎo)

（3）米氏常數(shù)的意義1、當(dāng)反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí)，即V=1/2Vmax,Km=[S],米氏常數(shù)的單位為摩爾/L。2、不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數(shù)。3、Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。4、Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)Km的測定：例題D-絲氨酸脫水酶需要磷酸吡哆醛作為輔酶。催化反應(yīng)：CH2OH·CHNH2·COOHCH3CO·COOH+NH3在實(shí)驗(yàn)中測定酶的磷酸吡哆醛飽和曲線得到下列數(shù)據(jù)：

[s]v磷酸吡哆醛10-5（M）

20分鐘生成丙酮酸（M）

0.200.1500.400.2000.850.2751.250.3151.700.3402.000.3508.000.360用這些數(shù)據(jù)求絲氨酸脫水酶對磷酸吡哆醛的表觀米氏常數(shù)。

vVm0.30.2Vm20.101234567810-6[S]丙酮酸M/20minVm=0.361/2Vm=0.18Km=3.210-6M解：1、v對[S]作圖法:

磷酸吡哆醛10-

5（M）

20分鐘生成丙酮酸（M）

[S]1/[S]v1/v0.205.00.1506.660.402.50.2005.000.851.170.2753.641.250.800.3153.171.700.580.3402.942.000.500.3502.868.000.1250.3602.78解2、1/v對1/[S]作圖法：7654321-4-3-2-10123451/v1/[S]

-1/Km=-2.85105Km=3.5110-6

1/Vm=2.55;Vm=0.392、酶濃度對反應(yīng)速度的影響反應(yīng)速度與酶濃度成正比：當(dāng)[S][E],式中Km可以忽略不計(jì)。k3[E][S]Km+[S]=k3[E]v=v[E]o0102030405060℃2.01.51.00.5溫度對唾液淀粉酶活性的影響產(chǎn)物麥芽糖的毫克數(shù)3、溫度對酶促反應(yīng)速度的影響酶的最適溫度:酶活性最高時(shí)的溫度,也即酶的催化效率最高,酶促反應(yīng)速度最大時(shí)的溫度。酶的最適pH:酶催化活性最高時(shí)的pH。2810pH酶的活性

pH對某些酶活性的影響A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶4、pH對酶促反應(yīng)速度的影響AB部分酶的最適pH值

酶最適pH胃蛋白酶1.8過氧化氫酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.85、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響抑制作用:直接或間接地影響酶的活性中心,使酶活性降低或喪失。抑制劑：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)。（1）不可逆抑制（irreversibleinhibition）

SH

SE+Hg2+EHg+2H+

SH

S

SH

Cl

SE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HCl

SH

Cl

S巰基酶路易士氣例1：巰基酶的抑制抑制劑與酶的必需基團(tuán)以牢固的共價(jià)鍵結(jié)合,使酶喪失活性,不能用透析超濾等物理方法除去抑制劑使酶恢復(fù)活性.

SEHg+

SCOONaCHSHCHSHCOONa

SHE+Hg

SHCOONaCHS

CHSCOONa二巰基丁二酸鈉

SCH2OHSHCH2OHEAs-CH=CHCl+CHSHE+CHS

SCH2SH

SHCH2SAs-CH=CHCl二巰基丙醇解毒方法：ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有機(jī)磷化合物羥基酶磷?；?失活)ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3

-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P例2：羥基酶的抑制羥基酶:有絲氨酸側(cè)鏈上的羥基為必需基團(tuán)的酶有機(jī)磷(敵百蟲、敵敵畏、對硫磷)不可逆抑制羥基酶的活性中心解磷定（2）可逆抑制(reversibleinhibition)抑制劑與酶以非共價(jià)鍵疏松結(jié)合引起酶活性的降低活喪失,結(jié)合是可逆的,能夠通過透析、超濾等物理方法使酶恢復(fù)活性?？赡嬉种祁愋停焊偁幮砸种?competitiveinhibition)非競爭性抑制（non-competitiveinhibition）反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）（3）競爭性抑制(competitiveinhibition)

概念競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)相似，與底物競爭同一種酶的活性中心,從而影響E與S的結(jié)合。競爭性抑制的底物濃度曲線競爭性抑制作用過程SSEEIIEE+P無I

有I

v[S]競爭性抑制的動力學(xué)方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax競爭性抑制的特征曲線：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km競爭性抑制的特點(diǎn)：I與S分子結(jié)構(gòu)相似；Vmax不變，表觀Km增大；抑制程度取決于I與E的親和力，以及[I]和[S]的相對濃度比例。

COOHCH2CH2COOH琥珀酸脫氫酶+FAD+FADH2

COOHCHCHCOOH琥珀酸延胡索酸對氨基苯甲酸二氫蝶呤FH2FH4

谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶磺胺藥(-)氨甲蝶呤(-)例：

COOHCH2COOH丙二酸（-）（4）非競爭性抑制non-competitiveinhibition）SSEEEE+PSESIIII概念抑制劑與酶分子活性中心以外的其它部位結(jié)合而抑制酶活性，I和S與酶結(jié)合不存在競爭關(guān)系。非競爭性抑制作用過程：

非競爭性抑制的動力學(xué)方程:1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+）[I]Ki非競爭性抑制的特征曲線：1v正常[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Ki非競爭性抑制的特點(diǎn)：1、I與S分子結(jié)構(gòu)不同；2、Vmax減小，表觀Km不變；3、抑制程度取決于[I]大小。Ag1+、Cu2+、Hg2+和Pb2+對酶的抑制質(zhì)子化的叔胺（R3NH+）對乙酰酯酶的抑制概念抑制劑僅與酶和底物的中間復(fù)合物結(jié)合而抑制酶活性。

反競爭性抑制作用過程：

EEE+PEIISSS（5）反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）反競爭性抑制的動力學(xué)方程:v=Vmax[S]Km+(1+[I]/Ki)[S]1v=KmVmax(1+)[I]Ki1[S]1Vmax反競爭性抑制的特征曲線：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km[I]Ki+(1+)-1Km1Vmax(1+)[I]Ki反競爭性抑制的特點(diǎn)：1、I與S分子結(jié)構(gòu)不同,I只與ES結(jié)合2、Vmax和表觀Km都減??；3、抑制程度取決于[I]和[ES]二者的濃度。氰化物或肼對芳香硫酸酯酶的抑制可逆性抑制作用的動力學(xué)比較作用特點(diǎn)無抑制劑競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制與I結(jié)合組分動力學(xué)參數(shù)表觀Km表觀Vm雙倒數(shù)作圖斜率縱軸截距橫軸截距KmVmKm/Vm1/Vm-1/KmEKm(1+[I]/Ki)VmKm(1+[I]/Ki)/Vm1/Vm1/Km(1+[I]/Ki)E、ESKmVm/(1+[I]/Ki)Km(1+[I]/Ki)/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-1/KmESKm/(1+[I]/Ki)Vm/(1+[I]/Ki)Km/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-(1+[I]/Ki)/Km6、激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響（1）激活劑:凡能使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。如：金屬離子：Mg2+、

K+、Mn2+陰離子：Cl-

有機(jī)物：膽汁酸鹽（2）分類：必需激活劑Mg2+對己糖激酶非必需激活劑Cl-

對淀粉酶四、酶活性測定1、酶活性酶的催化能力，以酶促反應(yīng)速度來衡量。2、酶活性單位指酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（s,min,h）內(nèi)生成一定量（mg,μg,μmol）的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需的酶量。一個國際單位（IU,1976年）：在特定條件下,1min內(nèi)使底物轉(zhuǎn)變1μmol所需的酶量；一個催量（kat）：在特定條件下,1Sec內(nèi)使底物轉(zhuǎn)變1mol所需的酶量

1I.U.=16.6710-9kat=16.6710-3

Kat；

1Kat=6107I.U.

酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力單位數(shù)。3、酶活力測定包括兩個階段：反應(yīng)階段和測定階段。一般采取如下步驟：(1)根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。要求底物均勻一致，具有一定的純度，新鮮配制。（2）確定酶促反應(yīng)的溫度，pH值等條件。溫度可選酶反應(yīng)最適溫度pH值應(yīng)是酶促反應(yīng)的最適pH值反應(yīng)條件在反應(yīng)過程中應(yīng)盡量保持恒定不變。(3)酶液與底物溶液在規(guī)定狀態(tài)下混合開始反應(yīng)。(4)適時(shí)測定產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。終止酶反應(yīng)的方法①加熱失活：酶反應(yīng)時(shí)間一到立即取出適量的反應(yīng)液，置于沸水浴中；②變性失活：酶反應(yīng)時(shí)間一到立即加入適宜的酶變性劑，如三氯醋酸等；③酸堿失活：酶反應(yīng)時(shí)間一到使反應(yīng)液的pH值迅速遠(yuǎn)離酶催化反應(yīng)的最適pH，從而終止反應(yīng)；④低溫失活：酶反應(yīng)時(shí)間一到將取出的反應(yīng)液立即置于冰粒堆中或冰鹽溶液中，使反應(yīng)液的溫度迅速降低至10℃以下。固定化酶的活力測定振蕩測定法：稱取一定重量的固定化酶，放在一定形狀，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的條件下，一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng)經(jīng)過一定時(shí)間，取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行測定。注意點(diǎn)：

（1）在振蕩或攪拌速度速度不高時(shí)，反應(yīng)速度隨振蕩或攪拌速度的增加而升高，在達(dá)到一定水平后不再升高。（2）若速度過大，可能引起固定化酶的結(jié)構(gòu)破壞，縮短固定化酶的使用壽命。（3）底物濃度，pH值，溫度，反應(yīng)時(shí)間等條件可與游離酶活力測定的條件相同。例題：某無細(xì)胞的粗提液，每mL含20mg蛋白質(zhì)。在0.5mL的標(biāo)準(zhǔn)總反應(yīng)體積中，含有10L這中提取液。在最適宜條件下，一分鐘內(nèi)生成30ng的產(chǎn)物。求：用下述單位表示反應(yīng)速度v:nmol/ml/min,nmol/L/min,mol/L/min,mol/L/min若10l該提取液，在1ml總反應(yīng)體積中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其反應(yīng)速度是多少？反應(yīng)混合液和提取液中酶活性濃度各是多少？酶制劑的比活力是多少？解：V=30/0.5=60nmol/ml/min=60103nmol/L/min=60mol/L/min=610-5mol/L/minV=30/1=30nmol/ml/min=310-5mol/L/min反應(yīng)液酶活性濃度=60nmol/ml/min

=0.06mol/ml/min=0.06單位/ml0.5ml的反應(yīng)液內(nèi)含0.03單位酶，即10l(0.01ml)提取液含0.03單位酶，所以：提取液酶活性濃度=0.03/0.01=3單位/ml酶比活=3/20=0.05單位/mg蛋白五、酶的分類與命名(一)分類1961年國際酶學(xué)委員會（EnzymeCommittee,EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把蛋白類酶分成6大類：1.氧化還原酶類：主要是催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞的氧化還原反應(yīng)。AH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（1）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)。AH2+BA+BH2（需輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ）（2）氧化酶類①催化底物脫氫，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脫氫，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）過氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（4）加氧酶（雙加氧酶和單加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（順，順-已二烯二酸）ROH+H2O+氧化型輔助因子RH+O2+還原型輔助因子（又稱羥化酶）2.轉(zhuǎn)移酶類：催化化合物中某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。A·X+BA+B·X根據(jù)X分成8個亞類：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、?；?、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶類：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH4.裂解酶類：催化非水解性地除去基團(tuán)而形成雙鍵的反應(yīng)或逆反應(yīng)。CH3C=OCOOHC—C鍵CH3C=OH+CO2C—O鍵CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N鍵COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35.異構(gòu)酶：催化各種異構(gòu)體之間的互變。AB常見的有消旋和變旋、醛酮異構(gòu)、順反異構(gòu)和變位酶類。6.合成酶類：催化有ATP參加的合成反應(yīng)。A+B+ATPA·B+ADP+Pi7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme（1）ribozyme的發(fā)現(xiàn)

80年代初期，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的ThomasCech和美國耶魯大學(xué)的SidneryAltan各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能.從而改變了生物催比劑的傳統(tǒng)概念。為此，T.Cech和S.Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學(xué)獎。（2）Ribozyme的種類根據(jù)催化底物是否是本身的RNA分為：分子內(nèi)酶（incis）包括：自我剪切酶、自我剪接酶