第八章mRNA剪接編輯

mRNA剪接編輯真核生物基因組DNA的結構真核基因大多是斷裂的:一個基因可由多個內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超過99%。RNA部分人類基因中內(nèi)含子序列所占的比重分析前體mRNA--hnRNA5’-Cap3‘-Poly(A)mRNA剪接成熟mRNA的轉運RNA加工過程及其生理功能斷裂基因hnRNA，hnRNP，sRNAExons(外顯子):thecodingsequencesIntrons(內(nèi)含子):theinterveningsequencesRNAsplicing:去除pre-mRNA的內(nèi)含子形成成熟mRNA的過程.Spliceosome剪接體Self-splicingintronsandmechanismsAlternativesplicing(可變剪接):有些pre-mRNAs可以通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同的成熟的mRNA.60%ofthehumangenesaresplicedinthismanner.hnRNAhnRNA(heterogeneousnuclearRNA):核內(nèi)不均一RNA，是mRNA的原初轉錄產(chǎn)物在核內(nèi)形成的大小不等的中間物，相對分子質量大，也不均一，成為hnRNA。hnRNA與mRNA的關系：兩者具有部分相同的序列；兩者都可以做翻譯的模板；兩者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴；兩者都是由RNA聚合酶轉錄hnRNPhnRNP:核糖核蛋白顆粒hnRNA的物理結構是核糖核蛋白顆粒(hnRNP)，顆粒中蛋白質包圍著hnRNA，這種hnRNA和蛋白質組成的復合物稱為hnRNP。1.mRNA加帽帽子結構(m7GpppGp-)7-甲基鳥核苷三磷酸:它由甲基化鳥苷酸經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5‘末端核苷酸相連，形成5’,5‘-三磷酸連接(5’,5‘-triphosphatelinkage)，mRNA5’端的這種結構稱為帽子(cap)。

反應空間：在mRNA的5‘-端加上m7GTP的結構。此過程發(fā)生在細胞核內(nèi)，即hnRNA即可進行加帽。加工過程:首先是在磷酸酶的作用下，將5'-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結構，再對G進行甲基化。加帽的順序 當新生RNA鏈長度約為25nt時，其5’端經(jīng)修飾被加上一個7-甲基G，以5’-5’三磷酸連接。RNA三磷酸酶(Triphosphatase)鳥苷酸轉移酶（guanyltransferase）鳥嘌呤-7-甲基轉移酶（guanosineethyltransferase） 反應步驟如下：核苷酸水解酶從RNA的5‘-端切掉γ基團；鳥苷酸轉移酶將來自GTP的GMP連接到RNA5’-端的β磷酸上，形成5-5三磷酸，釋放出PPI甲基轉移酶催化SAM的甲基轉移到Cap-0的N7位。CAP1:OCH3CAP2:OCH3CAP0SAMStep2Step1

GMPStep3RNA三磷酸酶鳥苷轉移酶帽子的類型在末端鳥苷的第7位上存在單個甲基化位點的稱O類帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-O位點上還有一個甲基位點的稱1類帽子(cap1)；此外，在第三個核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位點的稱2類帽子（cap2）。這三種帽子都有特殊面對面核苷酸結構（confrontednucleotidestructure）。HN—CH3m7G帽子0mRNA5端的帽子位置

和可被甲基化的位點三種5’帽結構形式帽0m7GpppXpYp------普遍存在帽1m7GpppXmpYp-----普遍存在帽2m7GpppXmpYmp-----很少發(fā)生帽子結構的功能有助于mRNA跨越核膜轉運;保護mRNA5′不被酶降解；使mRNA能與核糖體小亞基結合；被蛋白質合成的起始因子所識別，促進蛋白質合成;提高剪接效率2.PolyA尾巴多聚腺苷化的信號及參與的蛋白因子有效的信號是：AAUAAA及隨后的23-24nt的富GU區(qū)，再后的富U區(qū)。參與的蛋白因子： CPSF，CstF，CFI，CFII加尾反應需要的順式元件

3端添加多聚腺苷酸長度：20～200nt加尾信號：切割與加尾：

a.剪切/多聚腺苷酸化特異性因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor,CPSF）

b.剪切刺激因子（cleavagestimulationfactor,CstF）

c.剪切因子I，II（CFI，CFII）

d.poly(A)多聚酶（polyadenylatepolymerase,PAP）

e.poly(A)結合蛋白（poly(A)bindingprotein,PBP）mRNA的多聚腺苷酸化過程CPSF因子專一性與加尾信號AAUAAA結合CstF因子與富GU區(qū)結合CFI、CFII在加尾信號下游的15～25nt處切割poly(A)多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加約10個腺苷酸，速度較慢poly(A)結合蛋白的結合加快多聚酶延伸速度，控制多聚腺嘌呤尾巴的長度CPSFPAPPAPBPolII的CTD促進切割3端多聚腺苷酸尾巴的功能提高mRNA的穩(wěn)定性在核－質轉運中起作用提高mRNA的翻譯效率影響最后一個內(nèi)含子的切除創(chuàng)造終止密碼子UGA選擇性加尾調節(jié)基因的表達3.RNA剪接(Splicing)真核生物mRNA前體的剪接mRNA前體的加工內(nèi)容：

3.內(nèi)含子的剪接

1.5端添加帽子結構2.3端添加多聚腺苷酸1.mRNA依賴snRNA的拼接2.選擇拼接3.順式和反式拼接4.I型自我拼接5.II型自我拼接真核生物成熟mRNA形成的過程 斷裂基因發(fā)現(xiàn)不久，Crick（1978年）提出了一系列發(fā)人深思的問題：（1）剪切作用若是通過酶來進行的，那么這種剪接酶是怎樣識別RNA上特定的位點？（2）剪切酶有沒有特異性？對不同的RNA是否需要不同的酶？（3）切除的RNA是以線狀還是環(huán)狀存在的？切下的RNA的命運將如何？Chambon等分析比較了大量結構基因的內(nèi)含子切割位點，發(fā)現(xiàn)有2個特點：（1）內(nèi)含子的兩個末端并不存在同源或互補；（2）連接點具有很短的保守序列,亦稱邊界序列。100種內(nèi)含子的5′端都是GU；3′端都是AG，因此稱為GU-AG法則（GU-AGrule），又稱為Chambon法則。GU-AG法則5’splicesite(5’剪接位點):

theexon-intronboundaryatthe5’endoftheintron3’splicesite(3’剪接位點):

theexon-intronboundaryatthe3’endoftheintronBranchpointsite(分枝位點):anAclosetothe3’endoftheintron,whichisfollowedbyapolypyrimidinetract(Pytract).兩個剪接位點的序列是不同的，左邊的剪接位點稱供體（donor）位點，右邊的剪接位點稱受體（acceptor）位點。GU-AG法則（GU-AGrule）不適用于線粒體、葉綠體的內(nèi)含子，也不適用于酵母的tRNA基因mRNA結構特點邊界序列:其邊界序列是完全符合GU-AG法則分枝點序列：具有分枝點序列，位于內(nèi)含子3’端上游18-50nt處，序列為Py80NPy87Pu75APy95，其中A為百分之百的保守，且具有2’-OH。內(nèi)含子5′端有一保守序列(5’-GUAAGUA-3’)可以和U1snRNA的5’端的保守序列3’-CAUUUCAU-5’互補。mRNA的剪接轉錄產(chǎn)生的核內(nèi)RNA前體分子與蛋白質結合，形成RNA和蛋白質組成的snRNP復合物（ribonucleo-proteinparticle）。隨著RNA鏈的延伸，每個內(nèi)含子5’和3’兩端的復合物成對聯(lián)結，產(chǎn)生60S的顆粒—剪接體（spliceosome），進行RNA前體分子的剪接。細胞核中的小分子RNA稱為細胞核小RNA（smallnuclearRNA,snRNA);位于細胞質中的稱為細胞質小RNA(smallcytoplasmicRNA,scRNA)。在自然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白顆粒（SnRNP和scRNP）的形式存在，俗稱snurps和scyrps。在核仁中也存在著一類小的RNA，稱為核仁小RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA),它們在rRNA的加工中起作用。snRNA參與剪接過程，并于其它蛋白一起構成一個大的顆粒復合體,稱為剪接體(splicesome)。Spliceosome(剪接體)剪接過程由U1,U2,U4,U5,U6snRNPs催化，也有其他剪接因子的參與。這些snRNPs中的RNA成分與5’-和3’剪接點及分支點的多種保守堿基配對。Splicesome:ThelargeRNA-proteinbodyonwhichsplicingofnuclearmRNAprecursorsoccurs.剪接體中的snRNP的功能snRNPsnRNA(nt)在拼接中可能的作用U1165通過序列互補，結合到5拼接位點上U2185結合到分枝位點(U2AF)，催化轉酯反應,與U6配對U5/U4/U6116/145/106三聚體U5:結合5與3拼接點外顯子U4：拼接體的組裝U6：結合5拼接點，與U2一起催化轉酯反應

U2和U6構成催化反應的核心,U5拉近相鄰的2個外顯子U2snRNP可以與分支點序列配對U6snRNP可以與5‘端剪接區(qū)域配對真核生物mRNA前體中內(nèi)含子剪接過程示意圖由U1snRNA以堿基互補的方式識別mRNA前體5’剪接點，由結合在3’剪接點上游富嘧啶區(qū)的U2AF（U2auxiliaryfactor）識別3’剪接點并引導U2snRNP與分支點相結合，形成剪接前體（pre-spliceosome）。剪接前體進一步與U4、U5、U6snRNP三聚體相結合，形成剪接體。拼接體組裝第一次轉酯：左外元、內(nèi)元剪切套索第二次轉酯：exons連接、套索狀內(nèi)元釋放拼接體(spliceosome)解體與套索(lariat)降解同步ThesimplifiedmechanismofnuclearmRNAprecursor5’-splicingsite2‘-hydroxylgroupofAresidueofbranchpoint3’-splicingsiteLariart

Debranch°radedBiochemicalstepsofpre-mRNAsplicingacutismadeatthe5’splicesite,separatingtheleftexonandtherightintron-exon.Therightintron-exonmoleculeformsalariat(套馬索),inwhichthe5’-terminusoftheintronbecomeslinkedbya5’-2’bondtoabasewithintheintron.ThetargetbaseisanAinasequencethatiscalledthebranchsite.Step1ofSplicingStep1ofSplicingStep2:

cuttingatthe3’splicesitereleasesthefreeintroninlariatform,whiletherightexonisligated(spliced)totheleftexon.U6與U2配對,催化轉酯反應U5拉近相鄰外顯子第2次轉酯反應哺乳動物細胞中mRNA前體上的snRNP是從5’向下游“掃描”，選擇在分支點富嘧啶區(qū)3’下游的第一個AG作為剪接的3’受點。AG前一位核苷酸可以影響剪接效率，一般說來，CAG=UAG>AAG>GAG。如果mRNA前體上同時存在幾個AG，可能發(fā)生剪接競爭。4.可變剪接

ALTERNATIVESPLICING背景在高等真核生物個體發(fā)育或細胞分化過程中可以有選擇性地越過某些外顯子或某個剪接點進行可變剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA。脊椎動物中大約有5%的基因能以這種方式進行剪接，保證各同源蛋白質之間既具有大致相同的結構或功能域，又具有特定的性質差異，進而拓展了基因所攜帶的遺傳信息。DrosophilaDSCAMgenecanbesplicedin38,000alternativeways12×48×33×2=38016ByusingdifferentpromotersByusingdifferentpoly(A)sitesByretainingcertainintronsByretainingorremovingcertainexons小鼠免疫球蛋白重鏈基因的選擇性剪接可變剪接關于內(nèi)含子的不同形式Anexampleofconstitutivealternativesplicing:

SplicingoftheSV40TantigenRNA可變剪接使內(nèi)含子中的終止信號進入mRNA，翻譯提前終止可變剪接可以是組成型表達也可以是誘導型表達Constitutivealternativesplicing:morethanoneproductisalwaysmadefromapre-mRNA.

組成型可變剪接：前體mRNA通過可變剪接總能生成多種不同的mRNA。Regulativealternativesplicing:differentformsofmRNAareproducedatdifferenttime,underdifferentconditions,orindifferentcellortissuetypes.

誘導型可變剪接：前體mRNA在不同的發(fā)育階段、不同的生理調節(jié)、在不同的細胞或者組織中經(jīng)過可變剪接產(chǎn)生不同的成熟mRNA。Theoutcomeofalternativesplicing(可變剪接的結果/生物學功能)Producingmultipleproteinproducts,calledisoforms.Theycanhavesimilar,distinctorantagonisticfunctions.Onegeneencodesmultiplefunctions.

2. Switchingonandofftheexpressionofagivengenethatencodesonlyonefunction.Whentheexoncontainingastopisincludedtoproducenonfunctionalprotein,ortheintronisincludedtopreventmRNAtransport.順式和反式拼接

(cis-/trans-splicing)反式拼接：兩個或更多不同的基因的初始轉錄本上的外顯子被連接在一起。Cis-splicingtrans-splicing反式剪接（trans-splicing）

●以一條pre-RNA為底物以兩條不同來源的pre-RNA為底物

●在spliceosome中完成在spliceosome中完成

●組成型剪接在成熟RNA的5’端選擇性剪接拼接一外來的35Nt的splicedlead

(對供點或受點的識別差異)(SL,剪接前導序列)cis-splicing

tans-splicing

3.Self-splicingintrons自剪接內(nèi)含子Self-splicingintronsrevealthatRNAcancatalyzesplicing自剪接內(nèi)含子：

---前體RNA中的內(nèi)含子折疊形成特異性的構型，能夠催化自身內(nèi)含子的釋放和外顯子的鏈接。---Theycanremovethemselvesfrompre-RNAsintheabsenceofanyproteinsorotherRNAsinvitro.自剪接內(nèi)含子的類型兩類自剪接內(nèi)含子groupIself-splicingintronsgroupIIself-splicingintrons.I類內(nèi)含子常分布于低等真核生物的細胞器中四膜蟲，絨泡菌（Physarumpolycephalum）的rRNA；?大部分真菌如酶母的mtDNA；?植物葉綠體基因的內(nèi)含子；?酵母細胞色素B基因（ScCOB）；?原核生物-T4噬菌體的3個基因中也存在1類內(nèi)含子。I類內(nèi)含子的結構特點其邊界序列為5′U-G3′；自我剪切和自我環(huán)化，具有中部核心結構(Centralcorestrucature)和內(nèi)部引導順序(internalguideseguenceIGS)，在沒有蛋白輔因子存在的前體下RNA能直接催化體外自身的接合作用----核酶二價金屬離子對于折疊和催化作用來說是必需的，(Ca2+,Mg2+,Mn2+對折疊有幫助;Mg2+,Mn2+對催化有幫助)自環(huán)化需要鳥嘌呤核苷作為輔因子I類內(nèi)含子的自我剪接過程自由鳥苷酸的3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈。上游外顯子的自由3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開。上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連Ⅱ類內(nèi)含子和I類內(nèi)含子剪接不同；和核mRNA內(nèi)含子的剪切有些相似，但也有不同之處邊界序列為5′↓GUGCG……YnAG↓，符合GU-AG法則。二級結構的形成使兩個并列的功能區(qū)靠近。分支點序列（branch-pointsequence）在內(nèi)含子的3'，可和上游序列互補，形成莖環(huán)，但A不配對。Ⅱ類內(nèi)含子分布在：酵母mtRNA，細胞色素氧化酶的α亞基，β亞基，玉米mtRNA，tRNA真核mRNA前體中

d3d2

d4

d1

d5

d6A

GOH

活性中心

外顯子1外顯子2

Ⅱ類內(nèi)含子的二級結構分枝點腺苷酸的2’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，內(nèi)含子5′的邊界序列上的G以5′磷酸和分枝點A的2′-OH形成磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生了套索（lariat）結構上游外顯子的3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使套索結構完全解離。上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連II類內(nèi)含子的自我剪接過程三種類型的RNA剪接比較類型豐度機制催化方式套索結構pre-mRNAVerycommon;mosteukaryoticgenesTwosequentialtransesterificationreactions;branchsiteAspliceosome+GroupIIintronsRare;someeukaryoticgenesfromorganellesandprokaryotesSameaspre-mRNARNAenzymeencodedbyintron(ribozyme)