第八章mRNA剪接編輯

mRNA剪接編輯真核生物基因組DNA的結(jié)構(gòu)真核基因大多是斷裂的:一個(gè)基因可由多個(gè)內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超過99%。RNA部分人類基因中內(nèi)含子序列所占的比重分析前體mRNA--hnRNA5’-Cap3‘-Poly(A)mRNA剪接成熟mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA加工過程及其生理功能斷裂基因hnRNA，hnRNP，sRNAExons(外顯子):thecodingsequencesIntrons(內(nèi)含子):theinterveningsequencesRNAsplicing:去除pre-mRNA的內(nèi)含子形成成熟mRNA的過程.Spliceosome剪接體Self-splicingintronsandmechanismsAlternativesplicing(可變剪接):有些pre-mRNAs可以通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同的成熟的mRNA.60%ofthehumangenesaresplicedinthismanner.hnRNAhnRNA(heterogeneousnuclearRNA):核內(nèi)不均一RNA，是mRNA的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在核內(nèi)形成的大小不等的中間物，相對(duì)分子質(zhì)量大，也不均一，成為hnRNA。hnRNA與mRNA的關(guān)系：兩者具有部分相同的序列；兩者都可以做翻譯的模板；兩者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴；兩者都是由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄hnRNPhnRNP:核糖核蛋白顆粒hnRNA的物理結(jié)構(gòu)是核糖核蛋白顆粒(hnRNP)，顆粒中蛋白質(zhì)包圍著hnRNA，這種hnRNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物稱為hnRNP。1.mRNA加帽帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp-)7-甲基鳥核苷三磷酸:它由甲基化鳥苷酸經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5‘末端核苷酸相連，形成5’,5‘-三磷酸連接(5’,5‘-triphosphatelinkage)，mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子(cap)。

反應(yīng)空間：在mRNA的5‘-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即hnRNA即可進(jìn)行加帽。加工過程:首先是在磷酸酶的作用下，將5'-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對(duì)G進(jìn)行甲基化。加帽的順序 當(dāng)新生RNA鏈長度約為25nt時(shí)，其5’端經(jīng)修飾被加上一個(gè)7-甲基G，以5’-5’三磷酸連接。RNA三磷酸酶(Triphosphatase)鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（guanyltransferase）鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶（guanosineethyltransferase） 反應(yīng)步驟如下：核苷酸水解酶從RNA的5‘-端切掉γ基團(tuán)；鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶將來自GTP的GMP連接到RNA5’-端的β磷酸上，形成5-5三磷酸，釋放出PPI甲基轉(zhuǎn)移酶催化SAM的甲基轉(zhuǎn)移到Cap-0的N7位。CAP1:OCH3CAP2:OCH3CAP0SAMStep2Step1

GMPStep3RNA三磷酸酶鳥苷轉(zhuǎn)移酶帽子的類型在末端鳥苷的第7位上存在單個(gè)甲基化位點(diǎn)的稱O類帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-O位點(diǎn)上還有一個(gè)甲基位點(diǎn)的稱1類帽子(cap1)；此外，在第三個(gè)核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位點(diǎn)的稱2類帽子（cap2）。這三種帽子都有特殊面對(duì)面核苷酸結(jié)構(gòu)（confrontednucleotidestructure）。HN—CH3m7G帽子0mRNA5端的帽子位置

和可被甲基化的位點(diǎn)三種5’帽結(jié)構(gòu)形式帽0m7GpppXpYp------普遍存在帽1m7GpppXmpYp-----普遍存在帽2m7GpppXmpYmp-----很少發(fā)生帽子結(jié)構(gòu)的功能有助于mRNA跨越核膜轉(zhuǎn)運(yùn);保護(hù)mRNA5′不被酶降解；使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合；被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識(shí)別，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成;提高剪接效率2.PolyA尾巴多聚腺苷化的信號(hào)及參與的蛋白因子有效的信號(hào)是：AAUAAA及隨后的23-24nt的富GU區(qū)，再后的富U區(qū)。參與的蛋白因子： CPSF，CstF，CFI，CFII加尾反應(yīng)需要的順式元件

3端添加多聚腺苷酸長度：20～200nt加尾信號(hào)：切割與加尾：

a.剪切/多聚腺苷酸化特異性因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor,CPSF）

b.剪切刺激因子（cleavagestimulationfactor,CstF）

c.剪切因子I，II（CFI，CFII）

d.poly(A)多聚酶（polyadenylatepolymerase,PAP）

e.poly(A)結(jié)合蛋白（poly(A)bindingprotein,PBP）mRNA的多聚腺苷酸化過程CPSF因子專一性與加尾信號(hào)AAUAAA結(jié)合CstF因子與富GU區(qū)結(jié)合CFI、CFII在加尾信號(hào)下游的15～25nt處切割poly(A)多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加約10個(gè)腺苷酸，速度較慢poly(A)結(jié)合蛋白的結(jié)合加快多聚酶延伸速度，控制多聚腺嘌呤尾巴的長度CPSFPAPPAPBPolII的CTD促進(jìn)切割3端多聚腺苷酸尾巴的功能提高mRNA的穩(wěn)定性在核－質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用提高mRNA的翻譯效率影響最后一個(gè)內(nèi)含子的切除創(chuàng)造終止密碼子UGA選擇性加尾調(diào)節(jié)基因的表達(dá)3.RNA剪接(Splicing)真核生物mRNA前體的剪接mRNA前體的加工內(nèi)容：

3.內(nèi)含子的剪接

1.5端添加帽子結(jié)構(gòu)2.3端添加多聚腺苷酸1.mRNA依賴snRNA的拼接2.選擇拼接3.順式和反式拼接4.I型自我拼接5.II型自我拼接真核生物成熟mRNA形成的過程 斷裂基因發(fā)現(xiàn)不久，Crick（1978年）提出了一系列發(fā)人深思的問題：（1）剪切作用若是通過酶來進(jìn)行的，那么這種剪接酶是怎樣識(shí)別RNA上特定的位點(diǎn)？（2）剪切酶有沒有特異性？對(duì)不同的RNA是否需要不同的酶？（3）切除的RNA是以線狀還是環(huán)狀存在的？切下的RNA的命運(yùn)將如何？Chambon等分析比較了大量結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)含子切割位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)特點(diǎn)：（1）內(nèi)含子的兩個(gè)末端并不存在同源或互補(bǔ)；（2）連接點(diǎn)具有很短的保守序列,亦稱邊界序列。100種內(nèi)含子的5′端都是GU；3′端都是AG，因此稱為GU-AG法則（GU-AGrule），又稱為Chambon法則。GU-AG法則5’splicesite(5’剪接位點(diǎn)):

theexon-intronboundaryatthe5’endoftheintron3’splicesite(3’剪接位點(diǎn)):

theexon-intronboundaryatthe3’endoftheintronBranchpointsite(分枝位點(diǎn)):anAclosetothe3’endoftheintron,whichisfollowedbyapolypyrimidinetract(Pytract).兩個(gè)剪接位點(diǎn)的序列是不同的，左邊的剪接位點(diǎn)稱供體（donor）位點(diǎn)，右邊的剪接位點(diǎn)稱受體（acceptor）位點(diǎn)。GU-AG法則（GU-AGrule）不適用于線粒體、葉綠體的內(nèi)含子，也不適用于酵母的tRNA基因mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)邊界序列:其邊界序列是完全符合GU-AG法則分枝點(diǎn)序列：具有分枝點(diǎn)序列，位于內(nèi)含子3’端上游18-50nt處，序列為Py80NPy87Pu75APy95，其中A為百分之百的保守，且具有2’-OH。內(nèi)含子5′端有一保守序列(5’-GUAAGUA-3’)可以和U1snRNA的5’端的保守序列3’-CAUUUCAU-5’互補(bǔ)。mRNA的剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的核內(nèi)RNA前體分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA和蛋白質(zhì)組成的snRNP復(fù)合物（ribonucleo-proteinparticle）。隨著RNA鏈的延伸，每個(gè)內(nèi)含子5’和3’兩端的復(fù)合物成對(duì)聯(lián)結(jié)，產(chǎn)生60S的顆?！艚芋w（spliceosome），進(jìn)行RNA前體分子的剪接。細(xì)胞核中的小分子RNA稱為細(xì)胞核小RNA（smallnuclearRNA,snRNA);位于細(xì)胞質(zhì)中的稱為細(xì)胞質(zhì)小RNA(smallcytoplasmicRNA,scRNA)。在自然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白顆粒（SnRNP和scRNP）的形式存在，俗稱snurps和scyrps。在核仁中也存在著一類小的RNA，稱為核仁小RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA),它們?cè)趓RNA的加工中起作用。snRNA參與剪接過程，并于其它蛋白一起構(gòu)成一個(gè)大的顆粒復(fù)合體,稱為剪接體(splicesome)。Spliceosome(剪接體)剪接過程由U1,U2,U4,U5,U6snRNPs催化，也有其他剪接因子的參與。這些snRNPs中的RNA成分與5’-和3’剪接點(diǎn)及分支點(diǎn)的多種保守堿基配對(duì)。Splicesome:ThelargeRNA-proteinbodyonwhichsplicingofnuclearmRNAprecursorsoccurs.剪接體中的snRNP的功能snRNPsnRNA(nt)在拼接中可能的作用U1165通過序列互補(bǔ)，結(jié)合到5拼接位點(diǎn)上U2185結(jié)合到分枝位點(diǎn)(U2AF)，催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng),與U6配對(duì)U5/U4/U6116/145/106三聚體U5:結(jié)合5與3拼接點(diǎn)外顯子U4：拼接體的組裝U6：結(jié)合5拼接點(diǎn)，與U2一起催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

U2和U6構(gòu)成催化反應(yīng)的核心,U5拉近相鄰的2個(gè)外顯子U2snRNP可以與分支點(diǎn)序列配對(duì)U6snRNP可以與5‘端剪接區(qū)域配對(duì)真核生物mRNA前體中內(nèi)含子剪接過程示意圖由U1snRNA以堿基互補(bǔ)的方式識(shí)別mRNA前體5’剪接點(diǎn)，由結(jié)合在3’剪接點(diǎn)上游富嘧啶區(qū)的U2AF（U2auxiliaryfactor）識(shí)別3’剪接點(diǎn)并引導(dǎo)U2snRNP與分支點(diǎn)相結(jié)合，形成剪接前體（pre-spliceosome）。剪接前體進(jìn)一步與U4、U5、U6snRNP三聚體相結(jié)合，形成剪接體。拼接體組裝第一次轉(zhuǎn)酯：左外元、內(nèi)元剪切套索第二次轉(zhuǎn)酯：exons連接、套索狀內(nèi)元釋放拼接體(spliceosome)解體與套索(lariat)降解同步ThesimplifiedmechanismofnuclearmRNAprecursor5’-splicingsite2‘-hydroxylgroupofAresidueofbranchpoint3’-splicingsiteLariart

Debranch°radedBiochemicalstepsofpre-mRNAsplicingacutismadeatthe5’splicesite,separatingtheleftexonandtherightintron-exon.Therightintron-exonmoleculeformsalariat(套馬索),inwhichthe5’-terminusoftheintronbecomeslinkedbya5’-2’bondtoabasewithintheintron.ThetargetbaseisanAinasequencethatiscalledthebranchsite.Step1ofSplicingStep1ofSplicingStep2:

cuttingatthe3’splicesitereleasesthefreeintroninlariatform,whiletherightexonisligated(spliced)totheleftexon.U6與U2配對(duì),催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)U5拉近相鄰?fù)怙@子第2次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mRNA前體上的snRNP是從5’向下游“掃描”，選擇在分支點(diǎn)富嘧啶區(qū)3’下游的第一個(gè)AG作為剪接的3’受點(diǎn)。AG前一位核苷酸可以影響剪接效率，一般說來，CAG=UAG>AAG>GAG。如果mRNA前體上同時(shí)存在幾個(gè)AG，可能發(fā)生剪接競爭。4.可變剪接

ALTERNATIVESPLICING背景在高等真核生物個(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化過程中可以有選擇性地越過某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行可變剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA。脊椎動(dòng)物中大約有5%的基因能以這種方式進(jìn)行剪接，保證各同源蛋白質(zhì)之間既具有大致相同的結(jié)構(gòu)或功能域，又具有特定的性質(zhì)差異，進(jìn)而拓展了基因所攜帶的遺傳信息。DrosophilaDSCAMgenecanbesplicedin38,000alternativeways12×48×33×2=38016ByusingdifferentpromotersByusingdifferentpoly(A)sitesByretainingcertainintronsByretainingorremovingcertainexons小鼠免疫球蛋白重鏈基因的選擇性剪接可變剪接關(guān)于內(nèi)含子的不同形式Anexampleofconstitutivealternativesplicing:

SplicingoftheSV40TantigenRNA可變剪接使內(nèi)含子中的終止信號(hào)進(jìn)入mRNA，翻譯提前終止可變剪接可以是組成型表達(dá)也可以是誘導(dǎo)型表達(dá)Constitutivealternativesplicing:morethanoneproductisalwaysmadefromapre-mRNA.

組成型可變剪接：前體mRNA通過可變剪接總能生成多種不同的mRNA。Regulativealternativesplicing:differentformsofmRNAareproducedatdifferenttime,underdifferentconditions,orindifferentcellortissuetypes.

誘導(dǎo)型可變剪接：前體mRNA在不同的發(fā)育階段、不同的生理調(diào)節(jié)、在不同的細(xì)胞或者組織中經(jīng)過可變剪接產(chǎn)生不同的成熟mRNA。Theoutcomeofalternativesplicing(可變剪接的結(jié)果/生物學(xué)功能)Producingmultipleproteinproducts,calledisoforms.Theycanhavesimilar,distinctorantagonisticfunctions.Onegeneencodesmultiplefunctions.

2. Switchingonandofftheexpressionofagivengenethatencodesonlyonefunction.Whentheexoncontainingastopisincludedtoproducenonfunctionalprotein,ortheintronisincludedtopreventmRNAtransport.順式和反式拼接

(cis-/trans-splicing)反式拼接：兩個(gè)或更多不同的基因的初始轉(zhuǎn)錄本上的外顯子被連接在一起。Cis-splicingtrans-splicing反式剪接（trans-splicing）

●以一條pre-RNA為底物以兩條不同來源的pre-RNA為底物

●在spliceosome中完成在spliceosome中完成

●組成型剪接在成熟RNA的5’端選擇性剪接拼接一外來的35Nt的splicedlead

(對(duì)供點(diǎn)或受點(diǎn)的識(shí)別差異)(SL,剪接前導(dǎo)序列)cis-splicing

tans-splicing

3.Self-splicingintrons自剪接內(nèi)含子Self-splicingintronsrevealthatRNAcancatalyzesplicing自剪接內(nèi)含子：

---前體RNA中的內(nèi)含子折疊形成特異性的構(gòu)型，能夠催化自身內(nèi)含子的釋放和外顯子的鏈接。---Theycanremovethemselvesfrompre-RNAsintheabsenceofanyproteinsorotherRNAsinvitro.自剪接內(nèi)含子的類型兩類自剪接內(nèi)含子groupIself-splicingintronsgroupIIself-splicingintrons.I類內(nèi)含子常分布于低等真核生物的細(xì)胞器中四膜蟲，絨泡菌（Physarumpolycephalum）的rRNA；?大部分真菌如酶母的mtDNA；?植物葉綠體基因的內(nèi)含子；?酵母細(xì)胞色素B基因（ScCOB）；?原核生物-T4噬菌體的3個(gè)基因中也存在1類內(nèi)含子。I類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)其邊界序列為5′U-G3′；自我剪切和自我環(huán)化，具有中部核心結(jié)構(gòu)(Centralcorestrucature)和內(nèi)部引導(dǎo)順序(internalguideseguenceIGS)，在沒有蛋白輔因子存在的前體下RNA能直接催化體外自身的接合作用----核酶二價(jià)金屬離子對(duì)于折疊和催化作用來說是必需的，(Ca2+,Mg2+,Mn2+對(duì)折疊有幫助;Mg2+,Mn2+對(duì)催化有幫助)自環(huán)化需要鳥嘌呤核苷作為輔因子I類內(nèi)含子的自我剪接過程自由鳥苷酸的3’-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈。上游外顯子的自由3’-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開。上下游兩個(gè)外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連Ⅱ類內(nèi)含子和I類內(nèi)含子剪接不同；和核mRNA內(nèi)含子的剪切有些相似，但也有不同之處邊界序列為5′↓GUGCG……YnAG↓，符合GU-AG法則。二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成使兩個(gè)并列的功能區(qū)靠近。分支點(diǎn)序列（branch-pointsequence）在內(nèi)含子的3'，可和上游序列互補(bǔ)，形成莖環(huán)，但A不配對(duì)。Ⅱ類內(nèi)含子分布在：酵母mtRNA，細(xì)胞色素氧化酶的α亞基，β亞基，玉米mtRNA，tRNA真核mRNA前體中

d3d2

d4

d1

d5

d6A

GOH

活性中心

外顯子1外顯子2

Ⅱ類內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)分枝點(diǎn)腺苷酸的2’-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，內(nèi)含子5′的邊界序列上的G以5′磷酸和分枝點(diǎn)A的2′-OH形成磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)上游外顯子的3’-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使套索結(jié)構(gòu)完全解離。上下游兩個(gè)外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連II類內(nèi)含子的自我剪接過程三種類型的RNA剪接比較類型豐度機(jī)制催化方式套索結(jié)構(gòu)pre-mRNAVerycommon;mosteukaryoticgenesTwosequentialtransesterificationreactions;branchsiteAspliceosome+GroupIIintronsRare;someeukaryoticgenesfromorganellesandprokaryotesSameaspre-mRNARNAenzymeencodedbyintron(ribozyme)