噬菌體抗體庫在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用研究綜述,漁業(yè)論文

噬菌體抗體庫在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用研究綜述,漁業(yè)論文抗體庫(Antibodylibrary)技術(shù)主要是通過PCR技術(shù)克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，重組、構(gòu)建到特定的表示出載體中，在原核或真核生物體內(nèi)表示出出具有生物學(xué)功能的抗體分子，并通過親和挑選獲得特異性抗體。噬菌體抗體庫(Phageantibodylibrary)技術(shù)是迄今為止發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的制備抗體的技術(shù)，它是一種將PCR技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，并在噬菌體外表表示出、分泌，經(jīng)過挑選后獲得特異性抗體的技術(shù)。噬菌體抗體庫技術(shù)的基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因中，使外源DNA片段的表示出產(chǎn)物與噬菌體的外殼蛋白融合，展示于噬菌體外表，具有操作簡單、低成本以及技術(shù)成熟等特點(diǎn)，在商業(yè)生產(chǎn)中被成功應(yīng)用。當(dāng)前，噬菌體抗體庫分為Fv、Fab、單鏈抗體(Single-chainantibodyfragment)、單區(qū)抗體(Singledo-mainantibody)和雙鏈抗體(Diabody)等類型。單鏈抗體主要通過15個氨基酸序列(Gly4Ser)3linker將重鏈和輕鏈連接起來，具有體積小、免疫原性低的特點(diǎn)，不易引起人體或動物排擠反響。因其無抗體Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，由于片段分子量較低，能夠有效穿透致密的組織屏障到達(dá)病灶部位，在醫(yī)療診斷和疾病治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，成為當(dāng)代生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱門，被以為是21世紀(jì)的陽光產(chǎn)業(yè)。近年來，噬菌體抗體庫技術(shù)已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，在養(yǎng)殖病害防治、藥物殘留檢測、水體水質(zhì)監(jiān)測以及食品安全控制等方面已經(jīng)有不少報道。另外，也有學(xué)者將抗體庫技術(shù)與抗體芯片結(jié)合對多種水體病原菌進(jìn)行高通量檢測，為抗體庫在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。1、噬菌體抗體庫在水產(chǎn)病害防控中的研究1．1細(xì)菌性疾病的防治我們國家是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)品年總量約占世界總量的70%。由于環(huán)境的污染及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)本身的高密度、集約化生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害時有發(fā)生，每年造成近百億元的經(jīng)濟(jì)損失，華而不實(shí)細(xì)菌性疾病造成的危害和損失尤為嚴(yán)重。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種食源性的病源微生物，廣泛存在于浮游生物及海產(chǎn)品中，不僅能夠引發(fā)海產(chǎn)品的敗血癥，還會導(dǎo)致人的食物性中毒，引起惡心、嘔吐和腹瀉等腸胃炎疾病。當(dāng)前對于副溶血弧菌的致病機(jī)理尚不清楚，缺乏有效的預(yù)防與治療手段。三型分泌系統(tǒng)(T3SS)是已經(jīng)知道副溶血弧菌致病的主要因子之一，而T3SS毒力因子的運(yùn)輸管道Needle在其致病經(jīng)過中起著決定性作用。方遂等通過Overlap-PCR將VH、Linker和VL組裝成完好的scFv基因，同時將scFv基因克隆到噬菌體載體pCANTAB-5E上，成功構(gòu)建了噬菌體單鏈抗體文庫，測得該文庫庫容量約為1．4107cfu/ml。經(jīng)過富集、淘洗得到2株驗證無誤的單鏈抗體，經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)2株菌株可視為1株單鏈抗體，ELISA檢測結(jié)果表示清楚所挑選的單鏈抗體具有較高的抗體特異性。由于副溶血弧菌具有多個治病因子，將挑選到的單鏈抗體與副溶血弧菌的其他致病因子抗體結(jié)合，可制備多功能抗體，控制和治療副溶血弧菌的發(fā)生和擴(kuò)散。鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是海水魚及淡水魚中的重要致病菌，能夠感染虹鱒、鰻鱺、鱸魚、黃魚、石斑魚等幾十種魚類，致死率較高，在我們國家特別流行。夏永娟等成功構(gòu)建了抗鰻弧菌獨(dú)特型單克隆抗體dsFv基因，并使其準(zhǔn)確的在M13噬菌體外表獲得了呈現(xiàn)。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)抗鰻弧菌獨(dú)特型dsFv噬菌體能夠與抗原特異性結(jié)合，抗獨(dú)特型抗體能夠模擬抗原表位，能夠作為疫苗使用，而抗鰻弧菌獨(dú)特型dsFv噬菌體能夠通過細(xì)菌繁衍大量獲得，降低了疫苗的成本。該dsFv噬菌體有望成為用于預(yù)防魚類鰻弧菌感染的新一代基因工程疫苗。1．2病毒性疾病的防治草魚呼腸孤病毒(Reovirusofgrasscarp，GCRV)是我們國家分離的第1株魚類病毒，是引起我們國家草魚幼魚出血病大面積爆發(fā)的主要病原體，這種疾病一旦爆發(fā)，其死亡率可高達(dá)85%。陳叢琳等從已構(gòu)建的小鼠天然噬菌體展示抗體文庫中淘選并獲得了能夠特異性辨別草魚IgM的單鏈抗體，并在已鑒定的單鏈抗體陽性克隆中，挑選出對草魚IgM有較好的特異性結(jié)合的單鏈抗體C1B3。結(jié)果表示清楚，相對于病毒的其他構(gòu)造蛋白而言，VP7在草魚中能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反響，由此推導(dǎo)VP7應(yīng)是用于疫苗設(shè)計的首選抗原。該研究通過單鏈抗體，為草魚呼腸孤病毒及其他魚類病原體重組疫苗的研發(fā)提供了重要的分析手段和策略。張曉華等利用實(shí)驗室構(gòu)建的大容量天然噬菌體展示單鏈抗體文庫成功獲取了能夠辨別GCRVVP7的單鏈抗體，此抗體將成為后面進(jìn)一步研究病毒與細(xì)胞互相作用的有效工具。對蝦白斑綜合癥病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)為已經(jīng)知道基因組最大的動物病毒，嚴(yán)重危害水生甲殼動物養(yǎng)殖業(yè)。王曉潔等從抗WSSV單抗的細(xì)胞株中，采用間接熒光檢測法挑選出8株分泌較強(qiáng)的抗WSSV單抗的細(xì)胞株，可用于白斑綜合癥病毒快速檢測試劑盒的研制。試驗采用雙抗夾心免疫層析法，制成快速檢測、診斷WSSV的試紙條，整個反響只需5min，與以前檢測WSSV較快的斑點(diǎn)免疫印跡法需要3h相比，在很大程度上提高了檢測速度。白斑綜合癥病毒檢測試紙條是一種快速、簡便、準(zhǔn)確、合適于現(xiàn)場使用的WSSV檢測、診斷試紙條，且無假陽性。此試紙條尤其適于養(yǎng)殖人員現(xiàn)場、時事跟蹤、監(jiān)控、檢測，可為白斑癥的預(yù)防提供可靠的監(jiān)測根據(jù)。2、噬菌體抗體庫在水環(huán)境監(jiān)控的研究2．1藥物殘留檢測當(dāng)前，用化學(xué)藥物和抗生素治療魚類細(xì)菌性疾病是常用且較為有效的方式方法，但同時具有很多弊端，如藥物和抗生素在水產(chǎn)品中的殘留、病原生物耐藥性加強(qiáng)、水域生態(tài)污染等。在尋求病害防治的其他方式方法時，傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)獲得的抗體不僅費(fèi)時費(fèi)力，而且制備經(jīng)過較為復(fù)雜，無法知足高通量的需要，噬菌體抗體庫技術(shù)獲得的抗體具有簡單、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)?；前奉愃幬?Sulfonamides，SAs)為化學(xué)合成抗菌藥，由于其具有廣譜抗菌活性，且價格低廉，應(yīng)用廣泛，在醫(yī)學(xué)和動物的感染性疾病防治中具有重要地位，但不合理的使用容易引起過敏反響，造成耐藥菌增加，且動物性食品中殘留的藥物可能對人們的健康造成潛在的危害。趙琳等成功構(gòu)建斑點(diǎn)叉尾鮰天然Fab噬菌體抗體庫，最終得到的庫容量約為5．67107cfu/ml。在這里抗體庫的基礎(chǔ)上，閆曉敏等以偶聯(lián)卵血清蛋白的磺胺甲氧嗦(OVA-SMP)和磺胺甲惡哇(OVA-SMZ)為固相包被抗原，挑選并獲得了特異性較強(qiáng)的Fab抗體。王輝等成功建立了斑點(diǎn)叉尾蛔單鏈抗體(ScFv)抗體庫，并測定其庫容為5．8105cfu/ml。以O(shè)VA-SMZ為包被抗原，挑選到針對OVA-SMZ的抗體。2．2水質(zhì)監(jiān)測在養(yǎng)殖經(jīng)過中，投入過量的營養(yǎng)物質(zhì)、大量施肥和投餌等可導(dǎo)致水體中的氮、磷超標(biāo)，進(jìn)而引起藻類和浮游生物過度繁衍，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖的成活率。微囊藻素是從藍(lán)藻水華中分離出來的多肽毒素，能夠強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶的活性，對水產(chǎn)養(yǎng)殖和水體環(huán)境的危害比擬嚴(yán)重。已有大量文獻(xiàn)報道微囊毒素對魚類的危害，微囊毒素主要危害魚類鰓、肝、腎、消化器官、循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等。Zhao等利用噬菌體抗體庫技術(shù)以微囊藻毒素為包被抗原，從構(gòu)建的噬菌體抗體庫中成功挑選到特異性目的抗體，得到的目的抗體能夠快速簡單地對水體中微囊藻素進(jìn)行監(jiān)測，在水體水質(zhì)檢測上具有廣闊的應(yīng)用前景。3、噬菌體抗體庫在水產(chǎn)品安全控制的研究長久以來，河豚魚被以為是東亞以及東南亞居民餐桌上一道美味的魚類食物，但由于河豚毒素有劇毒，因而每年都會發(fā)生30～50例河豚魚中毒的事件。河豚毒素(Tetrodo-toxin，TTX)是河豚魚中最主要的一種毒素成分。劉立才等成功構(gòu)建抗河豚毒素(TTX)的重組的單鏈抗體(scFv)展示文庫，庫容量為1．5106cfu/ml，經(jīng)過6輪的淘選經(jīng)過，獲得了與河豚毒素特異性結(jié)合的抗體，該抗體庫的構(gòu)建為快速檢測河豚毒素提供了基礎(chǔ)。在熱帶和亞熱帶海域珊瑚礁的附近，有400多種魚因食用毒藻類而被毒化，華而不實(shí)包括梭魚、黑鱸和真鯛等重要海洋經(jīng)濟(jì)魚類，這些魚類統(tǒng)稱為雪卡魚。這些雪卡魚體內(nèi)都含有雪卡毒素，是一種可引起人類中毒的珊瑚魚毒素，毒性極強(qiáng)，比河豚毒素的毒性強(qiáng)20倍。雪卡毒素主要存在于肌肉、內(nèi)臟和生殖腺中，可引發(fā)神經(jīng)性中毒。Nagumo等通過噬菌體抗體庫技術(shù)成功挑選出抗雪卡魚毒素的特異性抗體，為今后雪卡魚毒素的研究及其檢測奠定了基礎(chǔ)。4、噬菌體抗體庫與抗體芯片結(jié)合的研究抗體芯片(Antibodymicroarrays)是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，又稱抗體微陣列，具有高特異性、高靈敏性、高通量及多樣品或多指標(biāo)平行分析的優(yōu)點(diǎn)，是免疫學(xué)研究的一種新技術(shù)，已被應(yīng)用到很多領(lǐng)域。王欣欣等用抗體芯片成功的對海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、延遲緩慢愛德華氏菌(Ed-wardsiellabacterium)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、海洋分支桿菌(Nontuberculoausmycobacteria)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、海洋分支桿菌(Nontuberculoausmycobacteria)等6種細(xì)菌進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測。在這里試驗中，應(yīng)用硫酸銨分級沉淀法進(jìn)行兔抗血清的純化，這能有效去除免疫血清中的非特異性抗體和雜蛋白，降低兔抗血清的非特異性吸附，進(jìn)而使其與其他菌株的穿插反響降到最低。通過ELISA對6種細(xì)菌與各菌株兔抗血清之間的穿插反響，分析發(fā)現(xiàn)純化后穿插反響明顯減小，用吸附純化后的抗體構(gòu)建的病原菌檢測抗體芯片的特異性顯著加強(qiáng)，因而可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的準(zhǔn)確檢測。廖瑋等利用pⅧ展示系統(tǒng)成功改良噬菌體抗體芯片，由于pⅧN端有多個帶電氨基酸，會增加非特異性吸附，這些帶電氨基酸會被陽性噬菌體上的融合抗體分子屏蔽，減少對蛋白質(zhì)的吸附，進(jìn)而降低了背景。降低pⅧ的非特異吸附，不僅能夠提高芯片的靈敏度，而且能夠降低非特異結(jié)合的背景，提高淘選效率，大幅度提高了噬菌體抗體芯片的靈敏度和信噪比，同時可為抗體庫在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新途徑。5、瞻望綜上所述，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體抗體庫技術(shù)展現(xiàn)出了宏大的應(yīng)用前景，已成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等問題的重要手段。同時隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的日益發(fā)展，噬菌體抗體庫技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用也具有廣闊的前景。但是，由于抗體庫技術(shù)在水產(chǎn)