ELISA基礎(chǔ)知識和注意事項(xiàng)

ELISA基礎(chǔ)知識和注意事項(xiàng)

類容ELISA的基本原理和相關(guān)概念特別說說捕獲法ELISA結(jié)果的影響因素ELISA結(jié)果的處理2/2/2023ELISA的基本原理和相關(guān)概念將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體后，這種酶標(biāo)抗原或抗體既能保留與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合的免疫活性，又同時(shí)保留酶的活性。

由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗體反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感性。2/2/2023ELISA的基本原理抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學(xué)活性而能相互特異性結(jié)合。2/2/2023抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)的二抗結(jié)合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關(guān)系，可進(jìn)行定性和定量分析。

2/2/2023ELISA的分類測抗原：競爭法（也可用于測抗體）、雙抗體夾心法。測抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法2/2/2023競爭法elisa競爭法ELISA原理——標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中的抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，顯色越淺。要用于小分子抗原或半抗原的定量測定，也可對抗體進(jìn)行測定。2/2/2023

包被特異性抗體

酶標(biāo)抗原檢測抗原孵育洗滌后顯色加樣AB競爭法ELISA3.顯色3.孵育1.加樣2/2/2023雙抗體夾心法雙抗體夾心法ELISA——將特異性抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)抗原相結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的第二特異性抗體與抗原結(jié)合，加入底物后顯色。檢測測抗原要有至少具有2個(gè)抗原決定簇2/2/2023包被特異性抗體雙抗體夾心法ELISA檢測抗原1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色酶標(biāo)特異性抗體2/2/2023雙抗原夾心法雙抗原夾心法ELISA——檢測標(biāo)本中的總抗體（包括IgM和IgG型抗體）。將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中特異性IgM和IgG型抗體結(jié)合，洗滌后加入酶標(biāo)的特異性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，洗滌后加入底物顯色2/2/20233.洗滌1.加樣2.孵育6.顯色5.孵育4.加入酶標(biāo)抗原雙抗原夾心法ELISA2/2/2023間接法間接法

ELISA（IndirectELISA）——將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗人IgG或IgM抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。酶標(biāo)二抗是針對一類免疫球蛋白分子只需要變換包被抗原，就可用一種酶標(biāo)二抗檢測各種與抗原結(jié)合的抗體2/2/20231.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色間接法ELISA2/2/2023捕獲法ELISA（CaptureELISA）——專門用來檢測IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本中所有人IgM抗體結(jié)合，洗滌后加入特異性抗原與相應(yīng)的特異性IgM抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗原特異性抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。2/2/20231.加樣2.孵育3.洗滌4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.顯色捕獲法ELISA2/2/2023區(qū)別理解檢測抗原？抗體？包被什么？標(biāo)記什么？

2/2/2023間接法和捕獲法比較間接法：假陰性，假陽性捕獲法：酶標(biāo)抗體的要求較高2/2/2023間接法的假陽性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM抗人酶標(biāo)IgM抗體類風(fēng)濕因子陽性結(jié)果假陽性結(jié)果2/2/2023間接法的假陰性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM酶標(biāo)抗人IgM抗體陽性結(jié)果假陰性結(jié)果2/2/2023ELISA的有關(guān)名詞概念質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不可用于標(biāo)定儀器或評價(jià)方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。2/2/2023室內(nèi)質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評：用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質(zhì)評?？梢岳斫鉃椤案鱾€(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評比”。2/2/2023臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的計(jì)算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色的情況。ELISA抗–HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個(gè)陽性顯色的情況。2/2/2023靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%測定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤（pannel）及臨床標(biāo)本陽性率。2/2/2023特異性：真陰性標(biāo)本的檢出能力。相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標(biāo)本陰性率。2/2/2023Elisa結(jié)果的影響因素

試劑盒的選擇標(biāo)本加樣與稀釋溫育洗版顯色質(zhì)控2/2/2023試劑盒的選擇同行的試劑使用情況上級部門對試劑實(shí)際使用的綜合評價(jià)使用臨界值質(zhì)控血清進(jìn)行實(shí)際檢測比較,選擇林敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)試劑盒2/2/2023標(biāo)本應(yīng)注意避免溶血在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃、超過一周測定的需－20℃保存盡量避免反復(fù)凍融（少量分裝）2/2/2023加樣和稀釋加樣本的準(zhǔn)確性（個(gè)人因素和實(shí)驗(yàn)條件）盡可能排除主關(guān)因素（盡可能用加樣槍，避免直接使用滴瓶）各種試劑盒標(biāo)本的稀釋使用，嚴(yán)格按照說明是操作2/2/2023溫育溫度水浴箱發(fā)硬板應(yīng)漂浮于水上或水面應(yīng)高于反應(yīng)板2/2/2023洗版

手洗洗板機(jī)（微孔液體殘留<2ul、浸泡時(shí)間>45s）2/2/2023顯色通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應(yīng)立即丟棄先加A后加B，顯色時(shí)間嚴(yán)格按說明書進(jìn)行終止后15內(nèi)比色2/2/2023質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控血清即刻法2/2/2023ELISA試劑的常見問題原因及其解決顯色淺，靈敏度低假陽性多，本底高甚至花板重復(fù)性不好白板2/2/2023顯色淺靈敏度低序號原因解決方法1試劑盒運(yùn)輸時(shí)間過長，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運(yùn)輸過程加放足夠冰袋并盡可能縮短運(yùn)輸時(shí)間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當(dāng)在4℃冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時(shí)已超出有效期。過期試劑盒不可以使用。4溫育時(shí)間不夠。嚴(yán)格按照說明書操作。5恒溫箱溫度達(dá)不到37℃。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門。經(jīng)常注意水箱中合適的水位。在保證水不沒過酶標(biāo)板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度。2/2/20236加樣量不足；移液時(shí)抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內(nèi)殘留液體過多。經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開啟時(shí)間過長，污染。試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短的時(shí)間內(nèi)用完，在保證正確貯存的前提最長不要超過。12不同批號試劑中混用不同批號試劑不能混用2/2/2023假陽性多，本底高甚至花板序號原因解決方法1試劑過期過期試劑不能使用2加樣時(shí)污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時(shí)污染對先加樣后加酶的操作，加酶時(shí)要注意吸頭不要接觸標(biāo)本，造成污染。當(dāng)可能造成污染時(shí)，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。5整個(gè)操作時(shí)間過長、造成反應(yīng)時(shí)間不同（第一孔與最后一孔反應(yīng)時(shí)間相差很懸殊）。氣溫高時(shí)更明顯。在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時(shí)）。2/2/20236洗液稀釋倍數(shù)過高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時(shí)浸泡時(shí)間不夠按要求操作，并適當(dāng)延長浸泡時(shí)間。9手工洗板方式不正確洗板時(shí)，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時(shí)間。10洗板機(jī)調(diào)試不正確或者有故障（可通過手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應(yīng)。顯色完立即終止反應(yīng)。2/2/2023重復(fù)性不好1加樣量多少不一，操作時(shí)間長短不一。重復(fù)同一樣品時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間相同；同時(shí)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后應(yīng)該將酶標(biāo)板放置在微量振蕩器上，充分混合；標(biāo)本保證一致、無污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。2加入標(biāo)本后沒有混勻。3重復(fù)實(shí)驗(yàn)的操作人員不同，操作習(xí)慣不同。4反應(yīng)時(shí)間、溫度等不相同。5標(biāo)本不同（被混淆或者處理不同）6精密度測定方法不標(biāo)準(zhǔn)采用正確的方法操作2/2/2023白板1忘記加酶嚴(yán)格按照說明書操作。2忘記加顯色液3酶或A、B液被污染失效防止組分被污染，注意保存。4把終止液當(dāng)A液注意液體組分加樣順序。2/2/2023結(jié)果處理OD值出現(xiàn)負(fù)值陰性對照值比空白小樣本OD值和cutoff接近

2/2/2023OD值出現(xiàn)負(fù)值

波長不對，酶標(biāo)儀上顯示的波長和實(shí)際的濾光片不對應(yīng)溶液里有沉淀

板子臟了，如果有能沖洗的洗板機(jī)可以沖洗bottom