elisa實驗ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定Enzyme-簡稱它繼

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光(一)ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(a)、用于檢測抗體夾心法及ELISA間接法。(二)方法一用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗33分鐘。加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，對照孔及陽性對照孔)?！娣?.5～1小時，洗滌加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，3710～30結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的對照OD值的2.1倍，即為陽性。用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次?！右欢ㄏ♂尩拇龣z樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、及陽性孔對照)↓37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW↓(三)試包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液): 1.59克 2.93加蒸餾水至洗滌緩沖液(PH7.4 0.2 2.9 8.0 0.2Tween-200.05％加蒸餾水至牛白蛋白(BSA)0.1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊、兔等與洗滌液配成5～10％使用終止液(2M底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2MNa２HPO４(28.4克／L25.7ml0.1M檸檬酸(19.2克 TMB(10mg／5ml無水乙醇)0.5ml ABTS使用液 正常人和陽性對照聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl100μl加樣器，塑料滴頭，(四)正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊、兔或BSA等封閉。在ELISA中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前（2）包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.010μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意