酶分離純化第二節(jié) 發(fā)酵液預(yù)處理

第二節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離1懸浮液的預(yù)處理1.1懸浮液的基本特性

(1)產(chǎn)物濃度低,1%-10%；(2)懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大；（3）固體離子可壓縮性大；（4）液相粘度大，多為非牛頓流體；（5）性質(zhì)不穩(wěn)定1懸浮液的預(yù)處理1.2預(yù)處理目的

a改變發(fā)酵液物理性質(zhì)b產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中c除去發(fā)酵液中部分雜質(zhì)1.3預(yù)處理方法1.3.1高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除Ca2+草酸Mg2+三聚磷酸鈉Fe3+黃血鹽（普魯士藍(lán)）1.3.2蛋白質(zhì)去除加熱調(diào)pH(草酸，無(wú)機(jī)酸或堿)有機(jī)溶劑蛋白沉淀劑1.3.3凝聚與絮凝

使細(xì)胞、細(xì)胞碎片及大分子物質(zhì)聚結(jié)成較大顆粒，便于提高過(guò)濾速率凝聚：指在電解質(zhì)作用下，由于膠體粒子(10-100nm)之間雙電層排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定相互聚集成大粒子（1mm）的現(xiàn)象。

機(jī)理：

a中和粒子表面電荷

b消除雙電層結(jié)構(gòu)絮凝：高分子聚合物將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過(guò)程。

機(jī)理：架橋作用絮凝劑應(yīng)用優(yōu)化a用量控制最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時(shí)所用的絮凝劑量。bpH控制c固體濃度與粒子尺寸分布d電解質(zhì)含量e后續(xù)工藝要求

常用的凝聚劑與絮凝劑凝集劑：鋁鹽，鐵鹽，鈣鹽，鋅鹽絮凝劑：

陽(yáng)離子型：陽(yáng)離子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯，聚二烯丙基四胺鹽。

陰離子型：聚丙烯酸鈉，聚苯乙烯磺酸，木質(zhì)素磺酸鹽

非離子型：聚氧乙烯

天然類：甲殼素

2固液分離

常用的分離方法有：

過(guò)濾與膜分離、離心分離等2.1過(guò)濾過(guò)濾是借助過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)。常用的有濾紙、濾布、纖維、多空陶瓷和各種高分子膜(膜分離)過(guò)濾的分類與特性類別截留顆粒的大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾＞2微米酵母、霉菌、動(dòng)植物細(xì)胞、固形物濾紙、濾布、纖維，多空陶瓷微濾0.2-2微米細(xì)菌、灰塵微濾膜超濾20A-0.2微米病毒，生物大分子超濾膜反滲透＜20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜影響過(guò)濾的因素菌種：真菌，放線菌，細(xì)菌培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未用完發(fā)酵時(shí)間：菌絲自溶前放罐改善過(guò)濾方法助濾劑：質(zhì)地堅(jiān)硬不可壓縮性固體

機(jī)理：表面吸附膠體及不可壓縮型格子結(jié)構(gòu)

使用方法：

a預(yù)先制成濾餅

b助濾劑混入懸浮液中一起過(guò)濾

常用助濾劑：硅藻土，珍珠巖，活性炭

應(yīng)用優(yōu)化因素

a單位質(zhì)量助濾劑的濾液最大產(chǎn)量

b使用周期

c流速2.2離心分離

指借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)。離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超過(guò)25Kr/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超過(guò)500Kg。（一）、差速離心（differentialcentrifugation）在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的物質(zhì)。由于各種物質(zhì)在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。差速離心只用于分離大小懸殊的物質(zhì)，更多用于分離細(xì)胞器。通過(guò)差速離心可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀（二）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。A等速度沉降，B等密度沉降1、速度沉降速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的物質(zhì)。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。顆粒在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。2、等密度沉降等密度沉降（isopycnicsedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。顆粒物質(zhì)在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的顆粒分離。2、等密度沉降等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。再者，這種方法所需要的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時(shí)間也較長(zhǎng)。大的離心力、長(zhǎng)的離心時(shí)間都對(duì)細(xì)胞不利。密度梯度混合器

貯藏室

混合室BA密度梯度混合器操作1、稀溶液置于B室，濃溶液置于混合室B，保持液面平等2、開(kāi)動(dòng)攪拌器3、同時(shí)打開(kāi)兩閥門(mén)4、離心管收集注意：1、若濃溶液置于B室，稀溶液置于A室，則梯度液導(dǎo)流管須插入離心管底部，讓后流入的高濃度混合液將先流入的低濃度的混合液頂起來(lái)。密度梯度混合器操作2、離心過(guò)程中，區(qū)帶位置和寬度隨離心時(shí)間的不同而改變。若離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)由于顆粒的擴(kuò)散作用，會(huì)使區(qū)帶變寬，影響離心效果，可適當(dāng)增加離心力縮短離心時(shí)間加以解決密度梯度混合器A=B截面積B＞A濃度體積B＜A線性梯度凸形梯度凹形梯度固液分離設(shè)備板框鼓式真空過(guò)濾機(jī)錯(cuò)流過(guò)