牛血清白蛋白的提取與鑒定

第八次實(shí)驗(yàn)：牛血清白蛋白的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)名稱牛血清白蛋白的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握鹽析法提取牛血清白蛋白2、掌握血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定牛血清白蛋白3、了解用溴甲酚綠鑒定血清蛋白實(shí)驗(yàn)原理1，蛋白質(zhì)是水化作用較強(qiáng)的高分子物質(zhì)，向其加入堿土金屬的中性鹽類可是蛋白質(zhì)膠粒脫水并失去電荷，從溶液中沉淀出來。球蛋白在半飽和的硫酸銨溶液中可析出，而清蛋白則需在飽和的硫酸銨溶液中可析出?？蓪⒀逯邪椎鞍着c其它球蛋白分離，最后用透析法除鹽，即可提取白蛋白。2，利用電泳過程中帶電粒子的移動(dòng)速度與粒子荷電量、電場強(qiáng)度、粒子重量與半徑及介質(zhì)的黏稠度等有關(guān)，可對(duì)牛血清白蛋白進(jìn)行分離與鑒定。3，血清中的白蛋白與溴甲酚綠在ph=4.2的條件下結(jié)合生成綠色化合物，溶液由黃色變?yōu)榫G色，而球蛋白基本不與之反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間可去除干擾，其顏色的深淺與白蛋白濃度成正比，可用于鑒定牛血清白蛋白。實(shí)驗(yàn)步驟（一）鹽析取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，充分混勻，然后靜止放置10分鐘，再離心（4000r/min）10min，將上清液傾入試管中。（二）透析取玻璃紙一張，折成袋形，將離心后的上清液倒入袋內(nèi)，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內(nèi)，使透析袋下半部侵入水中，對(duì)蛋白液進(jìn)行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時(shí)間。更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。將袋內(nèi)液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）BCG法鑒定白蛋白+溴甲酚綠ph=4.2 綠色復(fù)合物或（三）電泳鑒定（1）點(diǎn)樣取一張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處作點(diǎn)樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點(diǎn)樣器在同一張薄膜的點(diǎn)樣線處不同位置點(diǎn)樣。（2）電泳將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)膜條無光澤面向下，點(diǎn)樣端置于陰極，待平衡5min后，打開電源，調(diào)節(jié)電泳儀的電壓為160伏，通電60min，關(guān)閉電源后用鑷子將膜條取出。（3）染色將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鐘取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。（4）鑒定比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果，看位置是否一致。實(shí)驗(yàn)儀器和試劑儀器：離心管、離心機(jī)、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜、分光光度計(jì)。試劑：牛血清待測液、牛血清樣品、PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH為7.2的飽和硫酸銨溶液、溴甲酚綠、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。預(yù)測結(jié)果